DB32∕T 3681-2019 小麦产毒镰刀菌种群分子分型技术规范.pdf
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1、ICS 65.020.01 B 16 DB32 江苏省地方标准 DB32/T 36812019 小麦产毒镰刀菌种群分子分型技术 规范 Technical specification for molecular typing of toxin-producing fusarium species in wheat 2019 - 12 - 03 发布 2019 - 12 - 25 实施 江苏省市场监督管理局 发 布 DB32/T 36812019 I 前 言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由江苏省农业科学院提出并归口。 本标准起草单位:江苏省农业科学院。 本标准主要起草
2、人:邢宇俊、仇剑波、董飞、徐剑宏、史建荣、吴季荣、陆丹丹。DB32/T 36812019 1 小麦产毒镰刀菌种群分子分型技术规范 1 范围 本标准规定了小麦产毒镰刀菌种群以及产毒素化学型区分中镰刀菌DNA的提取、PCR扩增、电泳检测及结果判定方法和操作规范。 本标准适用于产毒镰刀菌种群及产毒化学类型的定性PCR检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件, 仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。 GB 4789.15 食品安全国家标准 食品微生物检验 霉菌和酵母计数 GB/T 6682 分析实
3、验室用水规格和试验方法 3 原理 产毒镰刀菌经过提取 DNA 后,利用特异性区分引物,通过普通 PCR 判断该样品是否为禾谷镰刀菌或亚洲镰刀菌。根据关键特异基因 Tri11 来区分该样品是否产生 3ADON、15ADON 或者雪腐镰刀烯醇 NIV 化学型。 4 试剂和材料 4.1 水:应符合 GB/T 6682 中一级水的规格。 4.2 PDA 培养基:按 GB4789.15 规定。 4.3 CTAB 缓冲液:55 mmol/L CTAB、1400 mmol/L 氯化钠(NaCl)、20 mmol/LEDTA、100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),121高压灭菌 20 min
4、,储存于 28。 4.4 TE 缓冲液。 4.5 RNA 酶溶液(5g/L)。 4.6 蛋白酶 K(20mg/mL)。 4.7 Tri 饱和酚。 4.8 酚:三氯甲烷:异丙醇(25:24:1);三氯甲烷:异戊醇(24:1)。 4.9 异丙醇。 4.10 区分禾谷镰刀菌和亚洲镰刀菌引物 Fg16F: 5-CTCCGGATATGTTGCGTCAA-3 Fg16R: 5-GGTAGGTATCCGACATGGCAA-3 预期亚洲镰刀菌扩增片段大小为 497 bp;预期禾谷镰刀菌扩增片段大小为 410 bp。 4.11 区分 3A-DON、5A-DON 和 NIV 化学型引物 DB32/T 368120
5、19 2 Tri11-CON: 5-GACTGCTCATGGAGACGCTG-3 Tri11-3ADON: 5-TCCTCATGCTCG GTGGACTCG-3 Tri11-15ADON: 5-TGGTCCAGT TGTCCGTATT-3 Tri11-NIV: 5-GTAGGTTCCATTGC TTGTTC-3 预期产 3ADON 毒素类型扩增片段大小为 334 bp; 产 15ADON 毒素类型扩增片段大小为 279bp ; 产 NIV毒素类型扩增片段大小为 497 bp。 4.12 无水乙醇。 4.13 DNA Ladder:可以清楚区分 100 bp1000 bp 的 DNA 片段。 4
6、.14 dNTPs 混合溶液:将浓度为 10 mmol/L 的 dATP、dTTP、dGTP、dCTP 四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合。 4.15 Taq DNA 聚合酶、PCR 扩增缓冲液及 25 mmol/L 氯化镁溶液。 4.16 50 TAE 缓冲液:称取 484g Tris,量取 114 mL 冰乙酸,200mL 0.5 mol/L EDTA,溶于水中,定容至 2 L。分装后高压灭菌备用。使用时用水稀释成 1 TAE 电泳缓冲液(工作液)。 4.17 加样缓冲液。 4.18 琼脂糖。 4.19 溴化乙锭。 5 主要仪器和设备 5.1 天平:感量 0.1 g 和 0.1 mg。 5.
7、2 PCR 扩增仪:升降温速度1.5 /s,孔间温度差异1.0 。 5.2 电泳槽、电泳仪等电泳装置。 5.3 紫外透射仪。 5.4 凝胶成像系统或照相系统。 5.5 高速冷冻离心机:转速不低于 12000 r/min。 5.6 培养箱。 6 检测 6.1 样品制备与培养 参照 GB 4789.15 对样品进行稀释与培养。 6.2 DNA 提取 从培养平皿上刮取菌丝 0.2 g0.5 g 于 1.5 mL 灭菌离心管中,加入少许石英砂用细玻璃棒充分碾碎菌丝,加入 500 L CTAB、40 L 蛋白酶 K,震荡均匀,65 C 水浴 30min;加入 500 L 酚:三氯甲烷:异戊醇(25:24
8、:1),强烈震荡,12000r/min 离心 15 min;吸取上层水相至 1.5 mL 离心管中,加入等体积的异丙醇, 震荡混匀, 12000r/min 离心 15 min; 弃上清液, 用预热至 65 C TE 缓冲液溶解 DNA (TE量视 DNA 沉淀的多少而定);加入 5 L RNA 酶溶液,37 C 水浴 30 min;加入 200 L 三氯甲烷:异戊醇(24:1),强烈震荡,12000r/min 离心 15 min;吸取上层水相至新的 1.5 mL 离心管中,加入等体积的异丙醇,震荡均匀,12000r/min 离心 10 min;弃上清液,加入 1 mL70%冰乙醇洗涤沉淀 DN
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