蛋白质的理化性质.pdf

1.4 蛋白质的理化性质蛋白质是高分子化合物，由于分子量 大，它在水溶液中所形成的颗粒直径约为1 100nm。胶体溶液具有布朗运动、丁达尔 现象、电泳现象、不能透过半透膜以及具 有吸附能力等特性。利用蛋白质不能透过半透膜的性质，可 以对蛋白质进行纯化，这是提纯蛋白质的 一种常用方法。一、蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质蛋白质的胶体性质蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子 量大小、所带的电荷和水化作用有关。生物体中最多的成分是水，蛋白质的 活动是在水中进行的，少量的亲水胶体可 与大量水分结合，形成各种流动性不同的 胶体系统。构成生物细胞的原生质，是异常复杂的 非均一性胶体系统。二、两性性质和等电点蛋白质和氨基酸一样，是两性电解 质。在蛋白质分子中，可解离基团除了肽 链末端的-氨基和-羧基外，主要的还 是肽链上氨基酸残基的一些侧链基团，如：NH2、COOH、-COOH、咪唑 基、胍基、OH等。可以把蛋白质分子看作是一个多价离 子，所带电荷的性质和数目是由蛋白质中 的可解离基的种类和数目以及溶液的pH值 所决定的。蛋白质的性质及等电点蛋白质的性质及等电点 蛋白质与多肽一样，能够发生两性离蛋白质与多肽一样，能够发生两性离 解，也有等电点(解，也有等电点(pI与等离子点pI与等离子点)。在等)。在等 电点时(Isoelectric电点时(Isoelectric point pI)，蛋白point pI)，蛋白 质的溶解度最小，在电场中不移动。质的溶解度最小，在电场中不移动。在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质 不同。蛋白质在等电点pH条件下，不发不同。蛋白质在等电点pH条件下，不发 生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。可以将蛋白质进行分离纯化。蛋白质的两性离解和电泳现象蛋白质的两性离解和电泳现象蛋白质的两性离解和电泳现象蛋白质的两性离解和电泳现象对于溶液中蛋白质颗粒，pH=pI时，蛋白质净电荷为零，蛋白质分 子在电场中不移动pHpI时，蛋白质净电荷为负，蛋白质 分子在电场中向阳极移动pHpI时，蛋白质净电荷为正，蛋白质 分子在电场中向阴极移动在pI时，蛋白质失去了胶体的稳定条 件，即没有相同电荷相互排斥的作用。所以 不稳定，溶解度最小，易沉淀。蛋白质在等电点的溶解度最小蛋白质在等电点的溶解度最小三、电泳 带电的胶体颗粒，在电场中向与其所带电 荷相反的电极移动，这种性质称为电泳。由于蛋白质颗粒上带有电荷，因此在电场 中能够泳动。蛋白质电泳的方向和速度主 要决定于其所带电荷的正负性、所带电荷 的多少以及分子颗粒大小和形状等。电泳电泳 利用蛋利用蛋 白质的白质的 电泳现电泳现 象，可象，可 以将蛋以将蛋 白质进白质进 行分离行分离 纯化。纯化。蛋白质的性质蛋白质的性质 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯大部分蛋白质均含有带芳香环的苯 丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在280nm附近有最大这三种氨基酸的在280nm附近有最大 光吸收。因此，大多数蛋白质在光吸收。因此，大多数蛋白质在 280nm 附近显示强的吸收。280nm 附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行利用这个性质，可以对蛋白质进行 定性定量鉴定。定性定量鉴定。蛋白质的紫外吸收蛋白质的紫外吸收5.1蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质 的结构状态，引起蛋白质理化性质改变 并导致其生理活性丧失。这种现象称为 蛋白质的5.1蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质 的结构状态，引起蛋白质理化性质改变 并导致其生理活性丧失。这种现象称为 蛋白质的变性变性(denaturation)。蛋白质的变性蛋白质的变性五、变性和凝固蛋白质在受热或在高浓度的尿素、盐酸蛋白质在受热或在高浓度的尿素、盐酸 胍等化学试剂存在下会丧失活性，该现胍等化学试剂存在下会丧失活性，该现 象称为蛋白质的 象称为蛋白质的变性变性变性 变性（denaturation）。蛋白质变性的化学）。蛋白质变性的化学 本质是高级结构的破坏（本质是高级结构的破坏（一级结构不被一级结构不被 破坏 破坏），特别是氢键的破坏。有些蛋白），特别是氢键的破坏。有些蛋白 质的变性是可逆的，通过适当的方法质的变性是可逆的，通过适当的方法 （如透析）将变性剂除去后，蛋白质可（如透析）将变性剂除去后，蛋白质可 以恢复其天然立体结构，这个过程称为 以恢复其天然立体结构，这个过程称为 复性复性复性复性（renaturation）。）。蛋白质的变性蛋白质的变性 变性蛋白质通常都是固体状态物质，变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也没有原来蛋不溶于水和其它溶剂，也没有原来蛋 白质所具有的性质。所以，蛋白质的白质所具有的性质。所以，蛋白质的 变性通常都伴随着不可逆沉淀。变性通常都伴随着不可逆沉淀。5.2 变性因素及作用机制 物理因素：加热、紫外线、X-射线、剧烈搅拌 等，这些因素能造成空间结构破坏，使 蛋白质变性。化学因素酸碱变性 重金属盐有机酸 有机溶剂结絮和凝固是变性深刻化的体现。变性因素及作用机制 尿素和盐酸胍变性：一般用8M脲和5M盐酸胍。许 多蛋白质以高度伸展的构象存在，寡聚蛋白质解 离成亚单位，另一些蛋白质则沉淀。其变性作用 的主要原因是破坏蛋白质的疏水键，使疏水基团 暴露。它们还能与多肽链上主链竞争氢键，破坏 蛋白质的二级结构。生物碱试剂变性：三氯醋酸、磷钨酸、水杨酸 等。在pHpI时，蛋白质带正电，和有机酸根离子 易结合形成沉淀，导致变性。重金属盐变性：在pHpI时，蛋白质带负电，更 易与重金属离子（Hg2、Pb2+、Cu2+）结合形成沉 淀，导致变性。5.3 变性蛋白质的特性 生物活性丧失或者降低，如：Hb变性不能输送 O2,酶变性失去催化作用。物理性质改变，如：溶解度降低，粘度升高，失去结晶能力，旋光值改变。化学性质改变，如：蛋白质变性时，有些原来 在分子内部包藏而不易与化学试剂起反应的侧 链活性基团，由于结构的伸展松散而暴露，易 与化学试剂反应。（如-SH、咪唑基、-OH）。生物化学性质改变：蛋白质变性后，分子结构 伸展松散，易为蛋白质水解酶所分解。变性蛋白质 变性理论1931年，我国生物化学前辈吴宪提出了“蛋白质 变性后，其肽链由原来紧密有序的构象变成了松散 无序的构象”。这就是变性作用，并且认为天然蛋白 质的紧密构造及晶体结构是由分子中的次级键互相 联系而形成的，所以容易被物理的和化学因素所破 坏，这个观点反映了蛋白质变性本质。变性的可逆性可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构可 以恢复原状。不可逆变性：除去变性因素，蛋白质空间结构 不能恢复原状。变性蛋白质一般轻度变性是可逆的，过度变性就是 不可逆的。例：胃蛋白酶加热至8090时，变性、无消化蛋白质的能力，失去溶解 性。如将温度下降到37，就复性，又恢 复溶解性和消化蛋白质的能力。但如变性 时间加长，条件加剧，变性程度加深，就 成为不可逆变性。变性蛋白质为什么能复性？在一定的环境条件下，蛋白质的一级 结构能够决定二、三、四级结构。变性 蛋白质的二、三、四级结构虽然遭到破 坏，但是一级结构仍然保持不变，因此 除去变性剂后，在适当的环境条件下，蛋白质能卷曲折叠成为能量最低的构 象，一般天然蛋白质正是具有这种能量 最低的构象。六、凝固作用、沉淀作用 凝固作用变性和凝固一般无明显区别，凝固是 变性的继续。沉淀作用 调pH值 加酸加碱后，蛋白质分子 的电荷变动引起斥吸力改变。盐析法 由于加入一定量的盐而使 蛋白质发生沉淀作用的现象称为盐析。盐溶 盐析沉淀作用 有机溶剂沉淀蛋白质 与水互溶的有 机溶剂（丙酮、乙醇等），这些溶剂与水的 亲和力大，能夺取蛋白质颗粒上的水化膜，加之有机溶剂的介电常数低，分子间引力加 大，蛋白质溶解度降低而沉淀。重金属盐沉淀蛋白质 生物碱试剂沉淀蛋白质 抗体对蛋白质的沉淀：抗原与特异性的抗体 蛋白结合发生沉淀。在温和条件下，通过改变溶液的pH或电 荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分 离。在温和条件下，通过改变溶液的pH或电 荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分 离。在沉淀过程中，Pr的结构和性质都没有 发生变化，在适当的条件下，可以重新 溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为在沉淀过程中，Pr的结构和性质都没有 发生变化，在适当的条件下，可以重新 溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非 变性沉淀非 变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方 法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶 剂沉淀法等。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方 法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶 剂沉淀法等。蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用可逆沉淀可逆沉淀可逆沉淀可逆沉淀 在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质 胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白 质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不 可能再溶解于水。可能再溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性 质的变化，所以又称为 质的变化，所以又称为变性沉淀变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉 淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用蛋白质的沉淀作用不可逆沉淀不可逆沉淀不可逆沉淀不可逆沉淀七、分子量的测定蛋白质分子量范围在60001.0106 根据化学组成测分子量用化学分析方法测出蛋白质中某一微 量元素的含量。并假设蛋白质分子中含有 一个被测元素的原子，则可由此计算出蛋 白质的最低分子量。例：猪心细胞色素C含铁量0.43，求其最低分 子量。解：Cyt C(Mw)=55.85/0.43%=13000其它方法测Cyt C(Mw)也是13000，说明 Cyt C只含一个Fe.例：Hb含铁量0.34，求其最低分子量。解：Hb(Mw)=55.85/0.34%=16700其它方法测得Mw是68000，说明Hb中含4个Fe.也可以利用蛋白质中含量特少的aa，用同样的原 理计算蛋白质的最低分子量。分子量的测定 渗透压法测分子量渗透压公式：M=CRT/超离心沉降测分子量 凝胶过滤法(分子排阻法)测分子量另外，还有SDS-PAGE法和数学求商 法等。八 蛋白质含量的测定八 蛋白质含量的测定?凯氏定氮法?凯氏定氮法?双羧脲法?双羧脲法?Folin-酚试剂法?Folin-酚试剂法?考马斯亮蓝法（Bradford法）?考马斯亮蓝法（Bradford法）?紫外吸收法?紫外吸收法G o H o m eG o H o m e