红细胞膜上各种磷脂中脂肪酸的测定.pdf

1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/分析化学研究报告红细胞膜上各种磷脂中脂肪酸的测定张抒峰”常理文中国科 学院化学研究所,北京摘耍应用自制硅胶板的薄层 色谱法分离了红细胞膜上四种主要磷脂。将分离后 的每种磷脂斑点硅胶涂层刮下,不经萃取,直接在无水甲醇一苯一乙酞氛溶液中进行转移甲基化,然后用毛细管气相色谱分离测定其脂肪酸组成和含量。上述方法已成功地用 于先天愚型病人和正常人红细胞膜上各种磷脂中脂肪酸轮廓分析,获得有意义的结果。关镇词磷脂,脂肪酸,色谱分析,红细胞膜引百磷脂是生物膜的基本结构和功能物质。它的组成和含量决定 了膜的通透性和流动性。磷脂酞链中不饱和键的增加会降低膜分子间排列的有序性和流动性,而随着 卵磷脂鞘磷脂比值降低,其流动性也下降。而膜的流动性将影响膜蛋白的构象与功能。分析研究细胞膜上磷脂以及各种磷脂中脂肪酸疏水侧链有助于膜疾病分子机理的研究。红细胞膜上脂肪酸分析方法已有很多报道,大多是测 定总脂中各种脂肪酸含量,一二,最近等报道了用分离磷脂并收集磷脂各组份,然后经一方法甲酷化,再用毛细管气 相色谱分析。我 们采用自制薄板的方法分离磷脂,将分离后的磷脂斑点刮下,经 乙酞氯法直接将磷脂 中脂肪酸进行转移甲基化,再经毛细管气相色谱分析,可以获得每种磷脂流水侧链脂肪酸的种类和含量轮廓,上述方法已成功地用于先天愚型病人和正常人红细胞膜上各种磷脂中脂肪酸和轮廓分析,取得 了有意义的结果。实验部分主要仪器与试剂型毛 细管气相色谱仪,装有检测器。冷 冻干燥机,一型低温高速离心机。积分仪。标准脂肪酸。、,。、。、,。,、。、。、。、。、。,、,。、。均 为美国公司产品。及,。表示十六碳烷酸,。及,表示有一双键的棕桐 油酸,依次类推磷脂酞胆碱,磷脂酞乙醇胺,磷脂酞丝氨酸,神经鞘磷脂均购 自公司。实验方法样品的采集和红细胞膜磷脂的提取与制备取经北京市城区普查 中确诊为先天愚型病人例,一岁和健康人例,岁静脉血各,以改进的方法,二收稿一一修改稿一一现在宁夏大学 化学 系工作 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/第卷分析化制备红细胞膜,红细胞膜中磷脂 的提取用方法川进行。最后将提取的混合磷脂溶解在拜一,中以备分析用。薄层板的制备与活化,称取工。溶于含梭甲基纤维素钠的溶液中。将一硅胶青岛硅胶厂 和上述溶液混合均匀后涂在预先洗净的玻璃板上又。,在室温下风干后,置于一烘箱内活化即可使用。磷脂组分的分离及各种磷脂中脂肪酸的甲基化将闪 含磷脂 的徉 品液和磷脂标准液点于 同一板上。采用两次展开方法。第一次用己烷一乙醚,展开,第二次用氛仿一甲醇一水“,展开。分离好的薄板用碘蒸气检出各磷脂组分斑点,将这些斑点硅胶涂层分别刮入带有聚四氟乙烯盖的小反应瓶中,加入甲醇一苯,和。叔乙酞氯。密封后在反应川,甲醋化产物用苯萃取浓缩后进行色谱分析。毛细管气相色谱分析条件色谱柱一键合石英毛细管柱义,液膜厚度。拜。操作条件 柱温起始温度,维持,以升温速率升温至,保持。汽化室温度,检测器温度载气 氢气,线速分流式进徉,分流比,。结 果与 讨 论薄层色谱分离磷脂的分离一般用硅胶板,但这种板十分昂贵,并且样品容量较 小,不适用于制备。本文采用自制 的薄层板分离红细胞膜上磷脂类物 质,可将中性脂和、磷脂满意地分离,见 图所示。气相色谱分离本文所采用的毛 细管气相色谱程序升温条件,可以在内将一饱和与不饱和长链脂肪酸甲醋全分离,见图。口二代阵二二,尾合膜样膜样标乍笨一乙图红细胞膜上磷脂在自制硅胶板上图图标准脂肪酸甲酷分离图脂肪酸甲酩化的回收率取拜和拌,经前述分离并进行甲醋化,与。林和拌不经而直接进行甲酷化相对比,其回收率列于表。由回收率实验 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/分析化学第卷证实了该方法是可靠的。由于磷脂中的不饱和脂肪酸在空气中易被氧化,故经分离后得到的含双键 的脂肪酸回收率较低。共进行次测定。脂肪酸的定性分析采用二 根极性不同 的毛细管柱一和一柱,以文献方法二计算标 准脂肪酸甲醋和每种磷脂中脂肪酸甲醋的保留指数相对照,结果列于表、表。从表、可知,红细胞 膜磷脂中和中 含有。、。、,、。长链脂肪酸,而和均含有。、。、。、。、。长链脂肪酸还 含。表甲醉一苯一乙醉抓甲醋化回收率脂肪成回收率写士士士。士士士。,俘咨,二哆口表一石英毛细管柱保留指数测定结果保留指致脂肪酸 甲留保留指致标准脂肪酸甲幽样品样品样 品样品名弓亏。公。,臼目,舀口,妇几,曰表一石英毛细管柱保留指教侧定结果保留指数旨 肪酸甲酸保留指数标准脂肪酸甲宙样品样品徉品样品忍。苏。磷脂中脂肪酸的定以,。甲醋为 内标,测定不同浓度脂肪酸甲醋而相同浓度的内标样,计算脂肪酸 甲醋色谱峰与内标峰面积比,求得 每种脂肪酸甲醋的直线回归方程,用此方 程可求未知样的含量。方法的应用用上述方法对先夭愚型病人组和正常人组的红细胞膜进行了轮廓分析,每种磷脂中脂肪酸甲醋的气相色谱图见 图和图。定性定量分析结果见表。对每种磷脂 中脂肪酸组成百分含量,依照卫生统计学进行检验分析,其值也列于表中。从表可看出正常对照组与先 夭愚型病人组红细胞膜磷脂中脂肪酸组成除相近外,其余、上的脂肪酸组成 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/第卷分析化学有 显著差别。病人组和中的和中。和,异常的原因之一。饱和脂肪酸显著增加,中。不饱和脂肪酸显著降低。这可能是膜功能亡贩贩乏,艺乙一亡图正常人红细胞膜上各种磷脂中脂肪酸 甲醋色谱 图图先天愚型病人红细胞膜上各种磷脂中脂肪酸甲醋色谱图表正常人和先天愚型病人红细胞膜上磷脂组分中脂肪酸组成百分含】,脂肪酸正常组病人组值正常组病人组值正常组病组值正常组演人组值,。土。土。毛。土。土仪】。士。今。士士毛,。士,。士。吸士么。士士么。出】。士士。士士。士土。士么一一一一士。土。士上一一一一,一一一一。士士。土土。名土。土。士,士么士。土一一名一一一一土土。士土。,一一一一土。士一一致谢北京友谊医院神经内科薛启宾教授和童小威医师提供了有关血徉,特致谢参考文献,杨福愉,黄芬,王金风生抽化学与生抽物理进展,刃甩,打一,盯徐桂芸,常理文,竺安,潘华珍,尹长城色讲,一反左,汉入二,鲍凤,许永瑞,张克,文德成生物化学与生物物理进展,伍从叱,上二 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House.All rights reserved.http:/分析化学第卷,中国医学科学院卫生所卫 生统计学北京人民卫生出版社,昭,一理,尸州岁,“万,一一,功,代,