DB15T 3259-2023羊肝细胞体外培养技术规程.pdf
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1、 ICS 65.020.30 CCS B 44 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 32592023 羊肝细胞体外培养技术规程 The code of practice on cells of lamb hepatic in vitro culture 2023-12-15 发布 2024-01-15 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧业科学院提出。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会(SAM/TC 19)归口。本文件起草单位:内蒙古自治区农牧业科
2、学院。本文件主要起草人:孙海洲、桑丹、金鹿、刘秀梅、张春华、杨鼎、张崇志、李胜利、王博、萨初拉、刘威、宝华、胡晓晓、李文婷、付乐。羊肝细胞体外培养技术规程 1 范围 本文件规定了羊肝细胞体外培养技术规程的程序确立、工作区条件和方法。本文件适用于羊的肝细胞体外培养。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。肝细胞体外培养 in vitro cu
3、lture of hepatic cells 以羊肝脏组织为材料,经体外培养、分离出呈圆球形、分散状态细胞的过程。4 设施设备 工作区应包括准备室、缓冲间、无菌室及细胞保存室。无菌室应配备超净工作台、紫外灯、酒精灯、二氧化碳培养箱等相关设备。细胞保存室应配备冰箱、超低温冰箱和液氮罐等设备。5 方法 试剂与溶液配制 5.1.1 如无特别说明,所用试剂均为分析纯。5.1.2 本标准所用水,一律应符合 GB/T 6682 中三级水。5.1.3 磷酸氢二钠、氯化钠、盐酸、氯化钙、氯化钾、氢氧化钠、磷酸氢二钾、氢氧化钾、葡萄糖、乙二胺四乙酸二钠、地塞米松、罗斯韦尔公园纪念研究所 1640 培养基(RPM
4、I1640)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(HEPES)、磷酸盐缓冲溶液(PBS)、胎牛血清、胰岛素、青霉素、链霉素、型胶原酶及0.4%台盼蓝溶液。5.1.4 肝素钠:将 1 g 肝素钠溶解于 20 mL 水中,用 0.22 m 滤膜过滤除菌,分装并保存于-20 冰箱中备用。5.1.5 型胶原酶:准确称取 50 mg 的型胶原酶粉末溶解于 1 mL 的基础培养液中,用 0.22 m 滤膜过滤除菌,即可配制成 50 g/L 的型胶原酶,配置完成后立即使用。5.1.6 双抗:准确称取 1 g 链霉素和 0.625 g 青霉素,充分溶解于 200 mL 的水中,用 0.22 m 滤膜过滤除菌,
5、分装并保存于-20 冰箱中备用。5.1.7 胰岛素母液:50 mg 胰岛素溶解于 20 mL 浓度为 0.01 mmol/L 的盐酸溶液中,配制成 4.36 mol/L10-4mol/L 的胰岛素母液,用 0.22 m 滤膜过滤除菌,分装并保存于-80 冰箱中备用。5.1.8 Percoll 细胞分离液:取 27 mL Percoll 液,加入 3 mL PBS 液(10)混匀,再从混匀的液体中取 9 mL 加入 15 mL PBS(1),与离心后的肝细胞沉淀混合。5.1.9 灌流液 A:准确称取 8.1816 g 氯化钠、0.4995 g 氯化钾、2.3831 g HEPES、0.4500
6、g 葡萄糖和 0.1861 g 乙二胺四乙酸二钠,溶于 800 mL 水中,加水定容至 1000 mL。用 1 mmol/L 盐酸或 l mmol/L氢氧化钠调整 pH 值为 7.2。在无菌超净工作台,按 1:100 mL 加入双抗,用 0.22 m 滤膜过滤除菌,4 保存备用,使用前 37 预热。5.1.10 灌流液 B:准确称取 8.1816 g 氯化钠、0.4995 g 氯化钾、6.8493 g HEPES、0.4500 g 葡萄糖和 0.5550 g 氯化钙,溶于 800 mL 水中,加水定容至 1000 mL。用 0.22 m 滤膜过滤除菌,4 保存备用,使用前 37 预热。5.1.
7、11 灌流液 C:在灌流液 B 的基础上,每 500 mL 灌流液 B 加入 2 mL 的 50 g/L 的 IV 胶原酶母液,使其含有 0.2 g/L 的 IV 胶原酶。用 0.22 m 滤膜过滤除菌,现配现用,使用前 37 预热。5.1.12 RPIM1640 基础培养液:将一袋 RPIM1640 粉末培养基于 1 L 超纯水中,加入 2.0 g 碳酸氢钠调节 pH 值,用 0.22 m 的过滤器过滤除菌,放 4C 冰箱冷藏备用。5.1.13 RPIM1640 贴壁培养液:在每 200 mL RPIM1640 基础培养液中加入 20 mL 胎牛血清、10-6 mol/L的胰岛素 0.460
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