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H7在脑损伤后血脑屏障损害中的作用
2010-01-15 李良平　徐如祥　王清华　杨志林

　　摘要：　目的　探讨蛋白激酶C(PKC)抑制剂H7在脑损伤后血脑屏障损害中的作用。方法　雄性SD大鼠48只，随机分为正常对照组、假手术组、脑损伤组和治疗组。治疗组于大鼠脑损伤后0.5小时腹腔注射PKC抑制H7(1mg/kg),12小时重复注射1次，伤后24小时应用分光光度计定量检测伊文氏兰渗出。结果　脑损伤后伊文氏兰明显渗出，治疗组渗出明显减少。结论　应用PKC抑制剂H7能明显阻止血脑屏障开放，可望在血脑屏障保护作用中提供新的治疗措施。
　　关键词：脑损伤；血脑屏障；信号转导
　　中图分类号：R651.102　　文献标识码：A
　　文章编号：1009-4237(2000)04-0210-03

Effects of H7 on blood-brain barrier damage in brain injury

LI Liang-ping,XU Ru-xiang,WANG Qing-hua,et al.
(Department of Neurosurgery,Zhujiang Hospital,First Military Medical University,Guangzhou 510282)

　　Abstract:　Objective　To explore the effects of H7,a protein kinase C(PKC) inhibitor,on BBB damage in brain injury.Methods　Forty-eight male SD rats were devided into 4 groups:control one,sham-operation one,brain injury one and H7-treatment one.The rats of the treatment group were peritoneally administered H7(1mg/kg)0.5h after brain injury and did the same 12h after brain injury.The permeation of Evans blue was observed quantitatively with a spectrophotometer.Results　Evans blue was significantly permeated in the injured group while insignificantly in the H7-treated rats.Conclusion　H7 can prevent BBB opening,which may provide a new way in BBB protection.
　　Key words:brain injury;blood-brain barrier;signal transduction

　　细胞内蛋白激酶C(PKC)激活可导致细胞通透性增加，脑微血管内皮细胞的PKC激活可导致血脑屏障的开放，脑水肿形成。研究脑损伤后PKC的信息转导通路可阐明血脑屏障损害的机理。
　　本研究采用伊文氏兰定量观察，探讨PKC抑制剂H7在脑损伤后血脑屏障损害中的作用。

材料与方法

1　实验分组
　　雄性SD大鼠48只，体重(250±30)g，随机分为正常对照组、假手术组、脑损伤组和H7治疗组，每组12只。治疗组于伤后0.5小时腹腔注射H7(1mg/kg)，12小时后重复注射1次，H7的剂量选择参照Joo的方法［1］。动物均于伤后24小时处死。
2　脑损伤模型的建立
　　采用改进的Feeney氏［2］自由落体硬膜外撞击方法。实验动物用10%水合氯醛(0.35g/kg体重)腹腔内注射麻醉后，头部固定于立体定向仪上，剪去顶部皮毛，消毒皮肤后，沿中线左侧切开头皮，分离骨膜，用牙科钻于中线旁2mm处，紧挨冠状缝后开一直径5mm的圆形窗，硬膜保持完整。用20g砝码于30cm高处通过一金属导杆坠落，撞击置于硬膜上的5mm直径的圆形锥上制成脑损伤模型，致伤冲击力为600gcm，硬膜外置明胶海绵止血，骨窗用锌汀粉封闭，缝合头皮，置鼠笼畏养。
　　正常对照组不做任何处理。假手术组仅切开头皮和颅骨开窗，不致脑损伤，术后24小时处死。
3　脑组织伊文氏兰含量的测定
　　大鼠均于处死前1小时股静脉注射2%伊文氏兰3ml/kg。取脑时，为清除血液中染料，用生理盐水左心室灌注至右心耳流出清亮液体。取损伤侧皮质、海马，对侧皮质、海马分别称重，加入二倍体积二甲基甲酰胺，50°C水浴中孵育72小时，1500g离心10分钟，取上清，应用分光光度计在伊文氏兰最大吸收光谱635nm处检测吸光度，从标准曲线上查得伊文氏兰含量结果以μg/g脑组织表示。
4　统计学处理
　　应用单因素方差分析和各组均数t检验处理，P＜0.05为显著性差异。

结　果

　　脑组织伊文氏兰定量测定结果：脑损伤后损伤侧皮质、海马，对侧皮质、海马伊文氏兰含量都明显高于正常对照组和假手术组。治疗组损伤侧海马、对侧皮质、海马，伊文氏兰含量接近正常，损伤侧皮质伊文氏兰含量明显高于正常对照组和假手术组，但明显低于脑损伤组(见附表、附图)。

附表　H7治疗后脑组织伊文氏兰含量的变化(±s)

组　别 n 伊文氏兰含量(μg/g脑组织)
　左侧皮质 右侧皮质 左侧海马 右侧海马
正常对照组 12 　10.15±1.06 10.31±1.22 10.62±0.89 11.67±0.84
假手术组 12 　10.96±0.43 10.87±0.37 10.61±0.66 10.55±0.49
脑损伤组 12 　237.41±15.48** 20.97±0.38 20.38±0.79** 15.67±1.19*
H7治疗组 12 　75.64±8.21**△△ 11.67±1.31△△ 11.96±0.76△△ 10.43±0.85△△

　　*：P＜0.05，**：P＜0.01，与正常组相比较；△：P＜0.05，△△：P＜0.01与脑损伤组相比较

L-左侧皮质　R-右侧皮质　LH-左侧海马　RH-右侧海马
N-正常组　S-假手术组　B-脑损伤组　H-H7治疗组
附图　H7治疗后脑组织伊文氏兰含量的变化

讨　论

　　PKC是内皮细胞信息转导通路的一个重要环节，调节内皮细胞通透性，在脑微血管内皮细胞中参与了血脑屏障通透性调节，与脑水肿的发生发展密切相关。Patterson［3］报道，在牛肺动脉内皮细胞单层，应用PKC抑制剂和下调PKC都能明显抑制百日咳毒素诱发的细胞间裂隙形成和通透性增加。Joo［1］报道在大鼠脑缺血模型中双侧颈内动脉结扎后，脑组织明显水肿，应用PKC抑制剂H7后，脑水肿明显减轻，提示PKC参与了血脑屏障开放的调节作用。本文通过对大鼠脑损伤后伊文氏兰渗出的定量研究，证明H7能明显阻止血脑屏障的开放。脑损伤后血脑屏障破坏分为可逆性损害和不可逆损害。各种介质作用的非直接损伤区，如同侧海马，对侧皮质、海马，血脑屏障可逆性开放，H7几乎能完全阻断血脑屏障可逆性开放。从本实验结果可知损伤侧周围皮质不可逆性损伤严重，存在血管断裂，伊文氏兰渗出最明显，H7部分阻断伊文氏渗出，达到60%。H7在脑损伤后血脑屏障损害中起着重要作用，有明显阻断血脑屏障开放的作用。
　　脑损伤后血脑屏障开放的主要方式是内皮细胞间裂隙形成，通透性增加，可能有二方面调节机制：(1)轴向的收缩，主要由肌球蛋白轻链激酶(MLCK)调节作用；(2)束缚力量，即细胞-细胞，细胞-基质粘附作用。PKC可使粘着斑蛋白激酶激活，作用于粘着斑蛋白和踝蛋白(vinculin and talin)等，使细胞骨架结构重组，细胞回缩，通透性增加［4，5］。脑损伤后各种神经介质和自由基释放可导致脑微血管内皮细胞PKC激活，细胞收缩和回缩，细胞间裂隙形成，通透性增加，血脑屏障开放，加重脑水肿的发生、发展。PKC抑制剂H7能阻止PKC的作用，阻止细胞骨架结构重排，减少内皮质细胞通透性，在脑微血管内皮细胞，阻止血脑屏障的开放。