猪流行性腹泻.pdf

1 猪流行性腹泻 1 病原学病原学 2 流行病学流行病学 3 发病机理发病机理 4 临床症状临床症状 5 病理变化病理变化 6 流行现状流行现状 7 诊断诊断 8 综合防治综合防治 9 综合防治重点难点解析综合防治重点难点解析 参考文献参考文献 最近几年，因病毒性腹泻疫情流行，给我国养猪产业乃至整个国民经济带来沉重打击。2011 年 4 月，因该年春节前后的猪病毒性腹泻流行，猪价一改之前一年多逐波下行的萎势，出人意料地快速飚升，使始于 2010 年初，经过近一年的财政紧缩，已于当年 12 月见顶回落的 CPI 再度扭头向上，紧缩的财政政策被逼再度紧缩。2011年 7 月，CPI 上升 6.5%，猪肉价格上涨 56.7%，推动 CPI 上升 1.46 个百分点。对于近几年猪病毒性腹泻的主要病因，虽然学者们至今仍意见不一，有人认为猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻仍然是主要致病病原，有人指出是猪流行性腹泻病毒发生了变异，还有研究指出是新的病毒博卡病毒或 CUBO 病毒1。但据珠海市赛比奥（原安富来）生物科技有限公司（以下简称赛比奥）猪病诊断实验室对广东省内外几十个病毒性腹泻发病猪场的临床调查和病原学检测：2011 年和 2012 年春节前后的猪病毒性腹泻疫情，70%以上的猪场是因猪流行性腹泻发病所引起；在母猪免疫过来源正当的猪病毒性腹泻三联弱毒苗（含猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻和轮状病毒三种抗原，以下简称腹泻三联弱毒苗）的猪场，100%是因猪流行性腹泻发病所引起。在现有技术条件下，来源正当的腹泻三联弱毒苗或某些实验室制作的腹泻二联弱毒苗（仅含有猪传染性胃肠炎和猪流行性腹泻两种抗原）对猪流行性腹泻的免疫效果均不够理想，或根本无效，但采取一些非常规的免疫手段对该病作免疫预防，可使该病得到有效控制。1 病原学 猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV），与猪传染性胃肠炎病毒、猫冠状病毒、犬胃肠炎病毒和人冠状病毒，同属于冠状病毒科（Coronaviridae）2 冠状病毒属（Coronavirus）属 1 群。PEDV 在肠上皮细胞的形态特征与其他冠状病毒相同，病毒通过胞浆内膜以出芽的方式进行装配。但在粪样中检测到的病毒粒子则具有多形性，并倾向于球形，直径约 95190nm（包括纤突在内）。大多数病毒粒子有一个电子不透明的中央区，顶端膨大的纤突长 1823nm，从核衣壳向外呈放射状排列2。基因组为单股正链具有感染性的 RNA，全 长 28 033nt。5端非翻译区（5UTR）长 296nt；3端非翻译区（3UTR）长 334nt。剩余基因组序列包括 6 个 ORF，从 53端依次为编码复制酶多聚蛋白 1ab（pp1ab）、纤突蛋白（S）、ORF3 蛋白、小膜蛋白（E）、膜糖蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）的基因。pp1ab 基因占全基因组 2/3，长20 346nt；S 基因、ORF3 蛋白基因、E 基因、M 基因和 N 基因长度依次为 4 152,675,231,681,1 326nt 3,4。pp1ab 分子质量约 753ku，主要功能包括负链 RNA、前导 RNA、sgmRNA 和子代病毒 RNA 的转录以及对多聚蛋白切割产生具有功能产物的蛋白酶切割，其在病毒感染早期发挥重要作用2,5。ORF3 蛋白分子质量约 25.3ku，据认为与病毒毒力有关5。以上两种蛋白，为病毒的非结构蛋白；其余 S,E,M,N 蛋白，则属于结构蛋白。S 蛋白是位于病毒粒子表面的纤突糖蛋白，分子质量 180220ku，由 1 383 个氨基酸组成，在病毒粒子与细胞表面受体结合后通过膜融合侵入宿主细胞和在感染宿主体内介导中和抗体产生的过程中发挥重要作用6。N 蛋白为磷酸化的核衣壳蛋白，分子质量5558ku，由 441 个氨基酸组成，与病毒基因组 RNA 相互缠绕形成病毒核衣壳。N蛋白在 PEDV 的结构蛋白中所占比例最大，在感染的细胞中能得到大量表达。猪在感染 PEDV 早期，体内就能产生高水平的抗 N 蛋白抗体，又鉴于冠状病毒 N 蛋白的保守性强，利用 N 蛋白来建立 PEDV 分子生物学诊断技术具有很好的应用前景7。M蛋白分子质量 2732ku，由 226 个氨基酸组成，在病毒粒子的组装和出芽过程中具有重要作用。因它能介导机体产生 干扰素，可以作为 PEDV 基因工程疫苗的候选抗原8。E 蛋白分子质量约 8.8ku，由 76 个氨基酸组成，为位于病毒囊膜上的小包膜蛋白，其对于病毒的组装和出芽，是非常必要的9。与其他冠状病毒相比，PEDV 分离培养相对比较困难。从 PEDV 发现开始，很多学者尝试用不同的方法将 PEDV 适应于细胞，但经过近 10 年努力未获成功10。直到1988 年，Hofmann 等首次在培养基含胰酶的 Vero 细胞上成功繁殖出 PEDV。此后，Kadoi 等又相继在仔猪膀胱、肾脏的原代细胞和 KSEK6、IB-RS-2、MA104、CPK、ESK 的传代细胞系上成功培养出 PEDV11。在国内，中国人民解放军农牧大学于 1982年首次将本病毒接种胎猪肠组织上皮细胞和胎猪小肠组织绒毛上皮细胞培养获得成功12。1991 年，李树根等13在细胞培养液加入胰酶（60g），将 PEDV 适应于 Vero、PK15 和 ST 传代细胞系获得成功。此后，哈尔滨兽医研究所又将 PEDV 适应于 Vero细胞增殖，并能顺利继代14。直到目前，PEDV 尚未被发现存在不同血清型。该病毒对乙醋和氯仿敏感，在蔗糖中的浮密度为 1.18g/mL。适应细胞培养的 3 PEDV 经 60C 处理 30min 失去感染力，但在 50C 条件下相对稳定。病毒耐酸能力较强，在 4C pH 4.09.0 以及 37C pH 6.57.5 条件下稳定。从患病仔猪的肠灌液中浓缩和纯化的病毒不能凝集家兔、小鼠、猪、豚鼠、绵羊、牛、马、雏鸡和人的红细胞，说明 PEDV 没有凝血活性。2 流行病学 本病仅发生于猪，各种年龄猪均可感染发病。哺乳仔猪、保育小猪和肥育猪的发病率很高，但以哺乳仔猪受害最为严重。母猪发病率变动很大，约为 15%90%。病猪是主要传染源，病毒存在于肠绒毛上皮和肠系膜淋巴结，随粪便排出后，污染环境、饲料、饮水、交通工具及用具而传染。本病多发生于冬春寒冷季节，每年 12 月至次年 3 月为发病高峰期。主要感染途径是消化道，但消化道不是唯一感染途径，PEDV 还可通过呼吸道和肌肉接种感染。经此 3 种途径感染的猪存在明显的临床差异：肌肉接种猪最易感，口服猪次之，滴鼻猪不易感。最早排毒出现在受感染后 2d（肌肉注射组），最迟排毒出现在受感染后 6d（滴鼻组）。感染猪在症状出现前即排毒，临床症状消失后很长一段时间（受感染后6374d），仍可在其粪便中检出 PEDV 15。如果猪场陆续有仔猪出生或断奶，病毒会不断感染新生仔猪和失去母源抗体保护的断奶仔猪，使本病呈地方流行性，新生仔猪和 58 周龄断奶仔猪持续性顽固性腹泻。3 发病机理 病毒经口和鼻感染后，直接进入小肠，并在小肠和结肠绒毛上皮细胞浆中进行复制（该病毒不能在其他脏器内增殖和复制）。病毒增殖首先造成细胞器损伤，继而出现细胞功能障碍，使肠绒毛萎缩，吸收表面积减少，小肠粘膜碱性磷酸酶含量显著减少，进而引起营养物质吸收障碍，这是造成腹泻的主要原因，属于渗透性腹泻。严重腹泻引起脱水，是导致死亡的主要原因14。免疫系统发育完善的小猪、肥育猪、母猪感染本病后具有较强的抗病力，7 日龄以上仔猪和成年猪都可见到明显的局部免疫反应。7 日龄内仔猪因免疫系统尚未完全发育成熟，受 PEDV 感染后，病毒在仔猪空肠中后段、回肠、盲肠粘膜绒毛柱状上皮细胞内复制和增殖，破坏肠粘膜柱状上皮细胞，引起肠绒毛裸露、断裂、融合及肠上皮细胞内各种酶类活性降低或缺乏，导致免疫系统破碎或损伤、消化功能障碍，呈现出脱水、腹泻等症状，严重者衰竭死亡。但 7 日龄内仔猪发病后，仍然存在抗损伤的防御反应，表现为肠粘膜上皮再生修复，肠粘膜集合淋巴结淋巴细胞增殖，肠粘膜集合淋巴结及肠粘膜固有层内的巨噬细胞捕捉病毒颗粒，呈递抗原给 T 辅助淋巴细胞和SmIg+B 淋巴细胞，使之转变为 IgM、IgA 和 IgG，进而阻止 PEDV 感染、定居、复制，修复损伤的肠绒毛上皮而逐渐痊愈16,17。4 PEDV 感染后，首先激发肠道粘膜局部体液免疫反应，继而刺激全身体液免疫反应。粘膜局部体液免疫以 IgA 为主，全身体液免疫以 IgG 为主。粘膜局部免疫反应早于全身免疫反应 36d。粘膜局部免疫反应周期短（约 30d 左右），全身免疫周期较长（约 60d 左右）17。4 临床症状 自然感染潜伏期一般 58d，人工感染潜伏期 824h。发病猪场常见初生小猪产后数小时发病。主要临床症状为水样腹泻，或腹泻兼呕吐。呕吐多发生于吃食或吃奶后，症状轻重因年龄大小而异，年龄越小，症状越重。发病率因猪场而异，在有的猪场，所有日龄猪均可感染发病，发病率高达 100%。7 日龄以内仔猪常在持续腹泻 34d 后脱水死亡，死亡率平均 50%，有时高达 100%。日龄较大的仔猪或肥育猪在同圈饲养的猪受感染后多全群腹泻，约 1 周后自然痊愈，死亡率 1%3%，对应激敏感的猪种或更高。死亡常见于腹泻早期或发生腹泻之前，剖检病死猪常可见背部肌肉坏死。成年猪症状较轻，有的仅表现为呕吐，重者水样腹泻，34d 自愈。与传染性胃肠炎相比，PEDV 在封闭猪场内不同育肥猪群间的传播速度较慢，病毒通常需要 46 周或以上才能感染不同猪舍的猪群。在暴发过急性腹泻的猪场，小猪断奶后 23 周可能出现持续性腹泻；产房 7 日龄内小猪常因受同群病猪或周围环境中病原感染，腹泻一批小猪接一批小猪地持续蔓延。最近几年，有的猪场在一年中最炎热的 7,8 月份，新生小猪腹泻发病依然存在。病猪体温正常或稍高，精神沉郁，食欲减退或废绝。断奶猪、母猪常呈现精神委顿、厌食和持续腹泻，约 1 周之后逐渐恢复正常，少数病猪康复后生长发育不良。哺乳小猪腹泻，呈现出病毒性腹泻共有的发病特征：（1）常整窝发病，厌食，不吃奶，由于缺少小猪吸吮刺激，母猪也因干奶而致逐渐无奶，个别母猪甚至受小猪粪便感染而出现腹泻症状。（2）腹泻粪便腥臭。（3）腹泻物粪便呈油性，并常粘满小猪全身。使小猪显得非常脏，全身油滑，抓住后很容易从手中滑脱。小猪康复后，被毛仍残存一层黑色油渍（如图 1）。（4）有喜欢爬到母猪身上睡觉的特异行为（如图 2）。这种行为，可能与腹泻造成腹痛有关。因小猪腹部疼痛，爬到母猪身上睡觉，可以利用母猪的体热，缓解腹部痛楚。5 病理变化 眼观变化仅限于小肠，小肠扩张，肠壁变薄，透明，内充满黄色液体，肠系膜充血，肠系膜淋巴结水肿，小肠绒毛缩短。组织学变化：见空肠段上皮细胞的空泡形成和表皮脱落，肠绒毛显著萎缩。绒毛长度与肠腺隐窝深度的比值由正常的 7:1 降到 2:1或 3:1。上皮细胞脱落最早发生于腹泻后 2h。超微结构变化主要发生于小肠细胞胞浆中，细胞器减少，出现电子半透明区，接 5 着微绒毛和末端网状结构消失，部分胞浆突入肠腔，肠细胞变平、紧密连接消失，脱落进入肠腔内。在结肠，含病毒的肠细胞出现一些细胞病变，但不见细胞脱落。图 1 病毒性腹泻发病小猪康复后被毛残存的油渍 图 2 病毒性腹泻发病小猪爱爬到母猪身上睡觉的特异行为 6 流行现状 在一些防疫条件不佳或产房、保育舍防潮保温设备比较落后的猪场，该病几乎每年都出现暴发性流行，并导致大批哺乳小猪乃至保育小猪脱水死亡。如猪场防疫条件较好，且产房、保育舍防潮保温设备比较先进，该病暴发的风险略低，但亦难以百分百保证不出现暴发流行。2011 年秋末至 2012 年夏初，全国 70%以上的猪场暴发此病。甚至在全年气温最高的 7,8 月份，仍有猪场出现暴发流行。显示 PEDV 的致病力，有逐步加强之势。除季节性暴发性 PED 外，另外一种非季节性散发性病毒性腹泻的流行规律容易被人忽视。其发病猪以哺乳小猪为主，有时也见保育小猪。一年四季均可发生，以散发为主，常见于一幢（或一个单元）产房内的一两窝小猪整窝发病，并呈现出以上所述哺乳小猪病毒性腹泻共有的四大发病特征，针对大肠杆菌或猪球虫的抗生素或抗球虫药治疗方案疗效极差，部分发病小猪寄养至其他母猪哺养后自然痊愈。虽然目前尚未有充足证据显示这种非季节性散发性病毒性腹泻与 PEDV 存在必然因果关系，但 从最近几年部分猪场 7,8 月份仍出现 PED 暴发流行，以及一些母猪产前坚持作腹泻三联弱毒苗跟胎免疫的猪场非季节性散发性病毒性腹泻基本可以根除等现象综合判断，PEDV 致病的可能性极大。7 诊断 生产上，如果观察到发病猪群出现如下临床症状：（1）水样腹泻，并因脱水而快速消瘦，萎缩；（2）哺乳小猪常整窝发病，有的小猪出生后 24 小时内即出现腹泻或呕吐症状；（3）腹泻粪便腥臭；（4）腹泻康复小猪全身沾满油渍；（5）部分发病哺乳 6 小猪有爱趴到母猪身上睡觉的特异行为，即可初步认定猪群存在猪病毒性腹泻流行。如果发病猪病料经实验室 PCR 检测存在 PED 病原，即可进一步确诊猪病毒性腹泻的主要病因，为猪流行性腹泻。送实验室作 PCR 检测的病料，须来自发病猪空肠后段至回肠段肠道及肠道内容物。采集方法：先用细线把须采样送检的肠道两端扎死，剪出该段肠道，连肠道内容物一起，-20冰箱急冻保存，并及时送实验室检测。8 综合防治 在现行条件下，PED 的预防和控制，存在一定技术难度。但只要加强对该病病原学和流行病学特征的认识，并在充分考虑这些因素的基础上，常规消毒方案与非常规免疫方案并用，PED 疫情仍可快速彻底被控制。8.1 日常日常免疫预防免疫预防 选 PED 新发病小猪（7 日龄以下）若干头，不作任何治疗处理。待发病 1224小时后，剖开小猪腹部，观察肠道变化，自肠壁变薄、肠道充满黄色水样液体的空肠后段始，至回盲交界处止，先两端用细线扎死，然后剪出该段小肠，收集该段肠道及肠道内容物作为制苗材料，在实验室按灭活疫苗制作程序，制成猪流行性腹泻组织灭活苗（每 mL 疫苗中应含制苗材料 0.5g 以上，以下简称腹泻组织灭活苗），与来源正当的腹泻三联弱毒苗联合应用，按如下免疫程序对种猪群作免疫预防。重胎母猪于预产期前 5 周免疫腹泻三联弱毒苗 1 次，每头颈部肌肉注射 2 头份。预产期前 3 周免疫腹泻组织灭活苗 1 次，每头颈部肌肉注射 10mL。具体如下表：猪别猪别 周龄周龄 疫苗种类疫苗种类 接种途径接种途径 免疫剂量免疫剂量 种猪种猪 产前 6 周母猪 种猪专用圆环苗/副猪嗜血杆菌苗 分左右肌注 2mL/2 mL 产前 5 周母猪 萎鼻苗/腹泻三联弱毒苗 分左右肌注 1 头份/2 头份 产前 4 周母猪 大肠杆菌苗/腹泻三联灭活苗*分左右肌注 2 mL/2 头份*平时无腹泻组织灭活苗可供选用时，选用来源正当的腹泻三联灭活苗代替，免疫剂量 2 头份，可一定程序降低 PED 暴发的风险。按以上免疫程序免疫，可同时有效预防 PED、猪传染性胃肠炎和轮状病毒。在作腹泻组织灭活苗免疫之前增加一次腹泻三联弱毒苗 PED 抗原的刺激，有利于提高腹泻组织灭活苗对 PED 的免疫效果，使母猪产生更高效的母源抗体。但真正对预防PED 发挥关键性作用者，还是腹泻组织灭活苗。8.2 疫情控制疫情控制 PED 疫情发生后，如果紧急免疫、空栏消毒和发病猪对症治疗等综合措施应用 7 得当，一般经过 2 周左右时间，疫情即可被有效控制，且疫情暴发对生产造成的损失可以降低至很小，甚至为零。8.2.1 紧急免疫 及时收集制苗材料制作腹泻组织灭活苗，产房所有母猪（包括哺乳母猪和待产母猪）和配种怀孕舍距预产期 35 天以内（妊娠 79 天以上）重胎母猪全群紧急免疫 1次，每头颈部肌肉注射 10mL。2 周后，以上猪群按相同免疫接种途径和免疫剂量再次紧急免疫 1 次。之后按 8.1 推荐的免疫程序对三种猪病毒性腹泻作日常免疫预防。8.2.2 空栏和消毒 哺乳小猪断奶空栏后，如果产床的漏缝地板能够拆开，最好把漏缝地板拆开后再消毒，以减少清洗和消毒存在的死角。拆开后的漏缝地板，冲洗干净后用 3%烧碱溶液浸泡。栏架、保温箱和生产用具等冲洗干净后，喷淋 3%烧碱溶液消毒。待产母猪上产房前 1 天，装上漏缝地板，产床、保温箱和生产用具等再次冲洗干净，用 0.25%消特灵喷雾消毒 1 次。坚决做到全进全出，合理安排好小猪断奶时间（必要时提前断奶），小猪断奶时母猪和小猪同时移出产房，保证每单元产室断奶后空置时间 5 天以上。产室空置期间，如果条件允许，24 小时连续负压抽风排气，置换空置产室的室内空气，并让产室内的尘埃自然漂散或干燥，以逐步减少空气中的尘埃量或通过自然干燥使尘埃中的 PED病原灭活。如果产室密封条件好，最好采用“福尔马林+高锰酸钾”的办法熏蒸消毒。此外，因 PEDV 通过肌肉注射易感，生产上还应考虑如何有效避免连续注射造成人为感染情况的发生。8.2.3 发病猪对症治疗 根据不同生产阶段的猪舍建筑结构、栏舍设备配套情况及 PED 对不同生产阶段猪群危害的严重程度，对于不同生产阶段的猪群，可考虑选择不同的治疗方案：（1）哺乳小猪。思密达，每天 2 次，每次每头 3g，温水调至糊状灌服，结合日常治疗黄白痢或猪球虫病常用的抗生素肌肉注射，直到腹泻症状停止。（2）保育小猪。饮水中添加食品级柠檬酸（添加量约 0.5%，以 pH 值达到 4 以下为准），必要时还可加入一些耐酸的抗生素，如：阿莫西林（250g/吨饮水）、强力霉素（150g/吨饮水）或阿奇环素（500g/吨饮水）。小猪饮用柠檬酸水，可增加胃肠道酸度，抑制 PEDV 在胃肠道内繁殖。保育小猪饮水中添加柠檬酸治疗，不但可以确保发病猪顺利康复，而且发病猪病程也可大大缩短。据赛比奥多个客户猪场反映：这种方法若应用得好，发病猪群一般在发病 34天后即可恢复正常采食，病情严重程度大大降低，基本能够做到腹泻对保育小猪的健康和后续生长无任何影响。一些哺乳后期出现腹泻症状的小猪，亦可考虑提前断奶至 8 保育舍让其饮用柠檬酸水，即可加快小猪痊愈，又可大大减少对发病小猪治疗的工作量。（3）中大猪。如果发病不很严重，可考虑让其自然耐过。反之，须考虑饲料中添加抗生素预防继发感染，并同时添加思密达（2kg/吨饲料），减少病毒感染对肠道粘膜的损伤。（4）种公猪、空怀或妊娠母猪、后备公母猪。无须治疗，让其自然耐过。（5）哺乳母猪。出现症状后须及时止泻，减少腹泻粪便对产床的污染。止泻方法：饲料中投喂思密达，1 日 2 餐，每餐 5g。颈部肌肉注射痢菌净（乙酰甲喹），每天 1 次，每次每千克体重 3 mg。9 综合防治重点难点解析 9.1 关于关于 PED 发发病病的的临床临床特征特征 除以上8.1所述经临床证实母猪经腹泻组织灭活苗免疫能够对哺乳小猪提供有效免疫保护外，生产上，经赛比奥技术团队对广东省内外近 50 个 PED 发病猪场的临床观察，发现 PED 的发病，还存在如下 2 个特征：（1）一些产前曾经出现过腹泻症状的母猪，产后哺乳小猪仍然腹泻。母猪经野毒感染所产生的母源抗体，不足以为哺乳小猪提供坚强的免疫保护。（2）一些成功应用腹泻组织苗紧急免疫控制了 PED 疫情的猪场，哺乳小猪一直很正常，但母猪零星的腹泻症状，却一直可以持续很长时间。9.2 关于关于 PED 的的免疫免疫机理机理 综合以上 PED 发病的临床表现，结合 PEDV 不能在其他脏器内增殖和复制，只能在小肠和结肠绒毛上皮细胞浆中进行复制的病原学特征，对于 PEDV 的免疫机理，可归纳为如下几点，并如图 4 所示：（1）消化道的局部感染，不能刺激机体产生有效的体液免疫反应，诱发具有免疫保护能力的体液免疫抗体。虽然由于 PEDV 不能在小肠和结肠绒毛细胞之外的其他脏器内增殖和复制，病毒侵入机体小肠和结肠绒毛细胞并在其中大量复制和增殖后，虽可通过淋巴和血液循环的转移有效接触机体的体液免疫系统，但因进入淋巴和血液循环后就不再复制和增殖，体液免疫系统所能接触到的抗原非常有限，难以产生高效的体液免疫抗体。（2）肌肉注射接种 PEDV 抗原，可有效刺激机体体液免疫反应，产生体液免疫抗体。只要 PEDV 抗原量够多，体液免疫反应所产生的母源抗体，足以为哺乳小猪提供有效的免疫保护。（3）PED 的免疫，主要依靠肠道局部细胞免疫。纵然可以通过肌肉注射疫苗刺激猪机体产生高效的体液免疫抗体，但因体液免疫抗体无法大量进入病猪的肠道及肠 9 道绒毛细胞，难以彻底中和肠道及肠道绒毛细胞中存在的大量 PEDV 病毒，发挥免疫抗体应有的免疫效能。图 4 PED 免疫机理示意图 9.3 免疫接种途径免疫接种途径问题问题 目前所有腹泻三联（或二联）弱毒苗的供应者，都主张该疫苗应作后海穴免疫注射，很多猪场也是按疫苗说明书推荐的方法作后海穴免疫注射。仅从保护母猪角度，如果选用 PED 弱毒苗，后海穴注射由于把疫苗推送至接近直肠的位置，能使病毒快速到达肠道，使病毒在肠道定植和复制，更好地刺激母猪肠道细胞局部粘膜免疫反应。但生产上免疫母猪的主要目的，不是为了保护母猪本身，而是希望通过免疫母猪刺激母猪产生高效的母源抗体以保护小猪。基于以上 9.1 的论述，由于肠道局部感染不能刺激有效的体液免疫反应，诱发具有免疫保护能力的母源抗体。因此，PED 疫苗不适宜用后海穴注射。9.4 疫苗质量问题及疫苗研疫苗质量问题及疫苗研发发方向方向 现阶段，品质保证的腹泻三联弱毒苗，市场的流通量非常稀少。很多猪场所选用的所谓腹泻三联弱毒苗，并不是真正意义上的三联苗。据赛比奥技术团队对多个客户 10 猪场所选用的腹泻三联弱毒苗进行 PCR 抽样检测：这些所谓的腹泻三联弱毒苗，都只含有 PEDV 和猪传染性胃肠炎两种抗原，不含轮状病毒抗原，只能被称为腹泻二联弱毒苗。从母猪免疫过来源正当的腹泻三联弱毒苗的猪场基本不会出现猪传染性胃肠炎和轮状病毒流行这一临床调查结果来看：来源正当的腹泻三联弱毒苗，对猪传染性胃肠炎和轮状病毒免疫效果确切，但对 PED 免疫效果较差或完全无效。对 PED 免疫效果较差的原因，乃疫苗中 PED 抗原含量不足。据赛比奥技术团队对某广泛被选用的腹泻三联弱毒苗检测，该疫苗中猪传染性胃肠炎和轮状病毒抗原含量，分别相当于PED 抗原含量的 25 倍和 2.5 倍。PED 发病猪每克小肠及肠道内容物混合物中 PEDV含量，相当于每头份腹泻三联弱毒苗中 PEDV 抗原含量的 200 倍以上！由于 PEDV 对细胞的适应性差，PEDV 细胞培养相当困难。如何有效提高疫苗中的 PED 抗原含量，乃是研制免疫效果确切的 PED 疫苗首先必须克服的技术障碍。此外，既然 PED 疫苗不适宜用后海穴注射，就只能选择肌肉注射。PEDV 虽然通过肌肉注射最易感，但因不能在小肠和结肠以外的其他脏器内增殖和复制，弱毒疫苗通过肌肉注射到达注射部位后，活病毒的数量并不能通过增殖的方式在体内进一步增加。选择肌肉注射接种，同等病毒含量的 PED 弱毒苗与灭活苗，免疫效果理论上并无差异。因此，未来 PED 疫苗的研究开发，应首先考虑以灭活苗为主。9.5 腹泻组织灭活苗腹泻组织灭活苗的免疫的免疫应用应用 每克 PED 发病小猪小肠及肠道内容物混合物中的 PEDV 含量，相当于每头份腹泻三联弱毒苗中 PEDV 抗原含量的 200 倍。母猪每次免疫腹泻组织灭活苗 10mL，含小肠及肠道内容物混合物 5g，其中的抗原含量，相当于每头份腹泻三联弱毒苗中抗原含量的 1000 倍。多个猪场的成功经验证明：腹泻组织灭活苗对 PED 免疫效果确切。在哺乳小猪PED 呈暴发流行的情况下，按 8.2.1 推荐的方法对母猪作过第 1 次紧急免疫约 2 周后，暴发流行的情况即可被有效控制。发病猪明显减少，腹泻脱水症状明显减轻，发病死亡率明显下降。如果配套空栏及消毒措施执行到位，疫情完全可以彻底被控制。腹泻组织灭活苗免疫应用成功的前提，是必须具备符合制苗要求的典型病料。为此，必须特别注意如下三个问题：（1）疫情流行阶段的把握。通常情况下，在疫情暴发初期，由于母猪母源抗体水平较低甚至完全没有，小猪发病最典型。在这个阶段，所采病料病毒含量最多，用这种病料制成的疫苗免疫效果最好。据实验室检测结果，这个阶段所采的病料，30%的检测样本稀释 400 倍 PCR 检测仍可观察到清晰的电泳条带（以下为叙述方便，稀释 x 倍 PCR 检测仍可观察到清晰电泳条带的检测样本抗原含量，用 x B 表示。30%的检测样本稀释 400 倍 PCR 检测仍可观察到清晰电泳条带，即 30%检测样本的抗原含量可达到 400 B）；100%检测样本抗原含量可达到 200 B。随着疫情发展，大部分 11 母猪在经受野毒感染后，逐渐产生母源抗体，因母源抗体对病毒存在中和作用，发病小猪肠道及肠道内容物中的病毒含量逐渐降低。最失败的情况是，有的猪场因为在疫情暴发初期舍不得多采病料，疫情控制一段时间后即无疫苗可用；有的猪场不严格按要求采集病料，用一些病毒含量达不到要求的病料制苗，经这类疫苗的紧急免疫后，发病严重程度虽有所降低，但疫情却一直无法有效彻底被控制。当这些猪场希望再次采集病料制苗时，已经很难再找到符合制苗要求的病料。疫情从此无望有效彻底被控制，除非有办法能够借用到一些新发病猪场病毒含量较高的病料。据实验室检测结果，在使用过腹泻组织灭活苗紧急免疫使疫情得到短暂控制的猪场，当小猪再度发病时，所采病料的病毒含量一般不超过 100 B，大多数猪场的检测结果在 50 B 上下，只能达到理想病料中病毒含量的 12.50%（即 1/8）。而据多个猪场的临床应用经验，病料中的病毒含量，至少要达到 200 B 以上，才能达到制苗的基本要求。（2）小猪发病时间的把握。小猪发病初期，肠道病变刚刚开始，发生病变的肠道长度较短，肠道及肠道内容物中的病毒含量有限。随着病程发展，发生病变的肠道逐步延长，肠道及肠道内容物中的病毒含量逐渐增多，并逐渐达到高峰。但高峰期过后，因肠粘膜不断脱落，肠壁逐渐变薄，肠壁所含病毒越来越少；随着肠道内容物逐渐被排空，随肠道粘膜脱落至肠道内容物的病毒也因之逐渐被排空，肠道内容物中的病毒也越来越少。生产上如要采集到病毒含量较高的病料，就必须根据发病小猪肠道及肠道内容物中病毒含量的这一变化规律，选择一个小猪发病恰当的时间点，以确保在这个发病时间点内，小猪肠道及肠道内容物中病毒含量最高。根据多个猪场的临床经验：这个时间点，一般在小猪开始出现呕吐或腹泻症状后的 1224 小时。在这个时间点内，剖出的小猪可见 70%以上肠道已出现病变，肠壁开始变薄，肠道充盈黄色或乳白色混浊液体（如图 3 左上）。如果剖杀过晚，小猪肠道虽 100%已出现病变，但肠道内容物已被排空，整个肠道充盈透明水样液体。这种透明水样液体，成份主要是肠道脱水渗出的体液，病毒含量不多（如图 3 左下）。（3）病变肠段的选取。理论上，由于 PEDV 主要在空肠中后段、回肠、盲肠粘膜绒毛柱状上皮细胞内复制和增殖，用以制苗的理想病料，应以自空肠中后段至盲肠之间，出现肠壁变薄、肠道充盈黄色或乳白色混浊液体的肠道及肠道内容物为主（如图 3 右上和右下）。但实际剖杀小猪时，经常发现结肠的肠道及肠道内容物似乎更符合制苗要求。现在大部分猪场之所以弃之不用，主要是考虑到结肠的肠道微生物比较复杂。但肠道微生物问题，技术上是可以通过灭活的方式妥善解决的。由于结肠的质量几近占整个肠道的一半，如果结肠可以用于制苗，可大大减少剖杀小猪的数量。因此，有关结肠是否可用于制苗问题，生产上值得进一步探讨。12 图 3 腹泻组织灭活苗制苗病料的选取 9.6 疫苗免疫疫苗免疫方案方案问题问题 现在的 PED，已经逐渐演变成一种常年性传染病。很多猪场仅仅在每年猪病毒性腹泻流行季节到来之前的 10 月份种猪全群普免 1 次，或 10 月份种猪全群普免 1次，11 月份加强免疫 1 次。依此方案，难以达到有效预防 PED 的效果。如上 9.1 和 9.2 所述，既然免疫过免疫确切的腹泻组织灭活苗的母猪仍难免出现腹泻症状，试图通过对成年种猪或小猪作主动免疫预防 PED，已然很不现实。种猪、保育、生长、育成猪的预防，只能依靠隔离消毒措施，平时严格执行兽医卫生防疫制度。PED 免疫预防主要目的，是有效提高母源抗体水平，确保初生小猪胃场道一直存在高效的母源抗体，以帮助初生小猪顺利渡过腹泻发病高死亡期。因此，PED 的疫苗免疫方案，应首选母猪跟胎免疫方案。9.7 反饲作用的局限性及其潜在危害反饲作用的局限性及其潜在危害 很多学者都主张反饲，不少猪场的技术人员也热衷于反饲。但生产实践证明：这些学者和技术人员可能都高估了反饲的作用。虽然部分猪场通过反饲幸运地控制了PED 流行，但这种幸运不能被当作一种成功经验广为传播。生产上，不少猪场都深受反饲之害。反饲相当于让母猪消化道接受 PED 野毒人工感染。如上 9.1 和 9.2 所述，由于消化道局部感染无法刺激机体产生有效的体液免疫反应，诱发具有保护能力的体液免疫抗体。通过收集腹泻发病小猪粪便投喂母猪、以期刺激母猪产生母源抗体为哺乳小猪提供免疫保护的反饲方法，其对于预防哺乳小猪发病的预期效果，实际非常有限。适得其反的是，由于母猪在 PEDV 感染期内，血液和乳液中均存在大量 PED 病 13 毒，且有的感染猪在临床症状消失很长时间（6374d）后仍可向外排毒，反饲方法若应用不当，如某些猪场所执行的反饲方案一样，定期于母猪预产期某个时间点进行反饲，其不但将人为导致 PED 野毒在母猪群中长期存在，延长母猪群 PEDV 带毒期，而且人为导致部分母猪乳液带毒，小猪哺食过带毒的初乳或常乳后，初生小猪因接触初乳中的病原而直接感染发病，哺乳小猪也将因持续受到常乳中的病原刺激而加剧腹泻和脱水症状。9.8 胎盘垂直感染传播问题胎盘垂直感染传播问题 最近几年的 PED 疫情，很多猪场小猪发病都比较早，有的哺乳小猪出生当日即出现腹泻症状。这很容易让人怀疑 PEDV 是否存在胎盘垂直感染途径。但从已有的研究18和多个猪场综合防治的临床经验来看：PEDV 不存在胎盘垂直感染传播。之所以小猪发病比较早，可能与 PED 的发病潜伏期较短有关。因发病潜伏期比较短，小猪自感染至出现症状的时间也就比较短。PEDV 人工感染的潜伏期仅为 824h，理论上，小猪出生 8 小时后，即有可能出现腹泻或呕吐症状。9.9 小猪乳前或早期感染问题小猪乳前或早期感染问题 既然母源抗体对哺乳小猪存在坚强的免疫保护，为什么一些坚持对母猪作腹泻组织灭活苗免疫的猪场，仍不时会出现哺乳小猪 PED 散发性发病呢？这其中存在一个小猪乳前或早期感染问题。虽然母源抗体对小猪存在免疫保护作用，但小猪自开始哺食初乳到初乳中的母源抗体对小猪产生健全的免疫保护需要一段时间（一般 710天），如果小猪在哺食初乳之前已经接触过 PED 病原，或虽在哺食初乳之前未接触过PED 病原但在初乳中母源抗体对小猪形成健全免疫保护之前接触过 PED 病原，仍会受这些病原感染而出现腹泻症状。发病潜伏期短，以及小猪乳前或早期感染的存在，为 PED 的综合防治带来巨大困扰，也是导致当前很多猪场 PED 疫情蔓延不止的关键性因素。9.10 空气传播途径问题空气传播途径问题 PEDV 呼吸道感染的感染力虽不强，但这种感染途径却是客观存在的。在一些PED 发病比较严重的猪场，产房室内弥漫着一股浓烈的、病毒性腹泻所特有的腥溴味，空气中漂浮着大量被 PED 病原污染过的尘埃粒子。如果空气中的 PED 病原净化不彻底，小猪通过呼吸接触到这些病原，或通过口舌接触到这些病原后，同样会受这些病原感染而发病。9.11 空栏消毒对于根治空栏消毒对于根治 PED 的关键性意义的关键性意义 无论初乳中母源抗体多么高效，只要小猪周围环境中仍然存在 PED 病原，且小猪在母源抗体对其产生有效免疫保护之前（正常情况下需要 710 天时间）接触到这 14 些病原，各种加强对母猪免疫以期通过母源抗体保护小猪的努力，都将化为泡影。小猪断奶后的产床空栏消毒和产房室内空气净化，是彻底切断 PED 病原从前一批哺乳小猪传染给后一批小哺乳小猪的唯一有效途径。在一些坚持对母猪作腹泻组织灭活苗免疫的猪场，之所以哺乳小猪仍不时会出现 PED 散发性发病，关键问题乃是空栏和消毒措施做得不够彻底，哺乳小猪乳前或在母源抗体对哺乳小猪形成坚强免疫保护之前已经接触到周围环境或空气中的 PED 病原。如果母猪已经按免疫程序作过腹泻组织灭活苗免疫，PED 疫情仍无法有效彻底被控制，必须进一步认真检讨一下如下几个方面的工作是否仍存在纰漏：第一、消毒剂的选用是否合理？因 PEDV 耐酸性较强，普通消毒剂（特别是一些猪场爱用的酸碘消毒剂）对 PEDV 的消毒效果都不是很理想，必须做到用两种以上不同成份的消毒剂各消毒一次，且其中一次必须选用烧碱。第二、空栏消毒是否留下卫生死角？空栏消毒如果做得不够细致，很容易留下卫生死角。若潜藏在这些卫生死角的 PED 病原不被彻底清除，空栏消毒仍然难以实现预期效果。第三，有没有充分考虑 PED 存在空气传播途径这一因素，采取相应措施对产房室内空气中的 PED 病源进行净化？在一些经过最严格空栏消毒措施 PED 仍难以根治的猪场，可能还需要考虑备用产栏方案。辟出适当数量远离产房的中大猪栏、公猪栏、后备母猪栏或妊娠母猪限位栏，作为备用产栏。平时只要观察到散发性病例，即时隔离至备用产栏饲养，空出的产栏即时喷洒 3%烧碱溶液消毒。如果发病数量多、病情严重且难以控制，须考虑把所有产房母猪和哺乳小猪隔离至备用产栏饲养，把所有产房全部空出，经彻底空栏消毒至少 7 天后，再上新的待产母猪。参考文献 1 郭林,唐利,刘昱.2011年病毒性腹泻的新特点和防控措施J.猪业科学,2012,(2):54-55.2 Sueyoshi M,Tsuda T,Yamazaki K,et al.An immunohistochemical investigation of Porcine epidemic diarrheaJ.Comp Path,1995,(113):59-67.3 Knipe DM,Howley PM,Griffin DE,et al.Fields virology(4thed)M.Philadelphia:Lippincott Williams&Wilkins,2001.4 Kocherhans R,Bridgen A,Ackermann M,et al.Completion of the Porcine epidemic diarrhoea coronavirus(PEDV)genomes equenceJ.Virus Genes,2001,23(2):137-144.5 Song DS,Yang JS,Oh JS,et al.Differentiaion of a Verocelladapted Porcine epidemic diarrhea virus from Korean field strains by restriction fragment length polymorph ismanalysis of ORF 3J.Vaccine,2003,21:1833-1842.6 Kang TJ,Seo JE,Kim DH,et al.Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of Porcine epidemic diarrhea virus and expression of its neutralizing epitope in plantsJ.Protein Expr Purif,2005,41(2):378-383.7 Lee HK,YeoS G.Cloning and sequence analysis of the nucleocapsid gene of Porcine epidemic 15 diarrhea virus Chinju 99J.Virus Genes,2003,26(2):207-212.8 Fan JH,Li