qPCR实验操作流程.doc
《qPCR实验操作流程.doc》由会员分享,可在线阅读,更多相关《qPCR实验操作流程.doc(6页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、Q-PCR实验流程一、 实验前准备,每天早上到实验室后,先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。超净台前做实验,需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套,RNA抽提需带口罩。取EP管/枪头时需用镊子,不可以用使用过的手套直接取用。取完EP管/枪头后,袋子及时封好。橡胶手套须放入超净台照射紫外,实验操作过程中不得带出超净台,移液器在一天工作结束后调至最大量程,并用75%乙醇清洁移液器,枪头盒及超净台面。实验进行的过程中或观看实验时,没有带口罩不要在超净台前讲话。二、 总RNA抽提1)细胞培养皿中细胞样品用1*PBS洗两次后,用1ml枪将PBS吸干净,加入1ml Trizol (Invitrogen
2、)溶液,吹打混匀,并吸至1.5ml RNase free EP管中使细胞充分裂解,室温静置5min;组织样品用液氮充分研磨,加入1ml Trizol (Invitrogen)溶液,混匀,室温放置5min使其充分裂解;(管盖与管壁都需标记样品名称)2) 加入200l氯仿,剧烈振荡混匀30s,使水相和有机相充分接触,室温静置3-5min;(离心时离心管按顺序排放,离心完毕,离心管的顺序也按顺序排好,与第一步的顺序一致)3) 4下,14,000g离心15min,可见分为三层,RNA在上层水相,移至另一个新的RNase free EP管;(用20-200ul的枪吸取上清,吸上清时,枪头应沿着液面上层吸
3、取上清,枪头不可碰到、吸到中间层)4) 沉淀RNA:加入等体积异丙醇,轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)(不应用振荡器混匀),室温静置10min;5) 4下,14,000g离心10min,收集RNA沉淀(如离心后仍不见EP管底部有沉淀,应将EP管放置在-80度冰箱过夜,继续在4下,14,000g离心10min,收集RNA沉淀),去上清;6) 用75乙醇洗涤两次(12,000g离心5min)(加入乙醇后只需轻轻颠倒EP管即可,不用振荡器震荡或枪头吸打沉淀),超净台风干;沉淀不能过干或过湿,过干则不易溶解,过湿则乙醇残留。7) 视沉淀量加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。三、去基因组 使用RN
4、ase-free的DNase (Promega),按以下体系配置反应液,37消化30min,65灭活10min。RNA DNase 10 x buffer H2O(RNase free) RNasin 30201039.50.5lllll总体积100l 然后按以下步骤操作: 1) 加入等体积的苯酚/氯仿,上下颠倒混匀,室温放置5min,后14,000rpm,离心15min,取上清。2) 加入等体积的氯仿,上下颠倒混匀,静置分层后14,000rpm,离心15min,取上清。3) 加入等体积异丙醇,轻柔地充分混匀(颠倒6-8次),-20静置15min;4) 4下,14,000g离心15min,收集
5、RNA沉淀,去上清;5) 用75乙醇洗涤两次(12,000g离心5min),超净台风干;6) 加入适量DEPC水(至少15ul)溶解沉淀。四、总RNA纯度和完整性检测1) 纯度检测:取1l RNA样品50倍稀释,在核酸蛋白检测仪上测定OD值,OD260/OD280的比值大于1.8,说明制备的RNA较纯,无蛋白质污染。2) 总RNA完整性检测:取RNA样品1l,1琼脂糖凝胶电泳80V20min,EB染色10min,用凝胶成像系统观察并拍照,总RNA的5s rRNA, 18s rRNA和28s rRNA条带,三条条带完整的话即可证明总RNA抽提比较完整。五、逆转录1. mRNA:1) 在RNase
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- qPCR 实验 操作 流程
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【Fis****915】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【Fis****915】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。