动物肝脏中DNA的提取及检测实验报告.doc
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1、动物肝脏中DNA的提取及检测一、前言脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(DNA,为英文Deoxyribonucleicacid的缩写),又称去氧核糖核酸,是脱氧核糖核酸染色体的主要化学成分,同时也是组成基因的材料。有时也被称为“遗传微粒”,原因是在繁殖过程中,父代会把它们自己DNA的一部分复制传递到子代中,从而完成性状的传播。DNA是高分子聚合物,DNA溶液为高分子溶液,具有很高的粘度,可被甲基绿染成绿色。DNA对紫外线(260nm)有吸收作用,利用这一特性,可以对DNA进行含量测定。当核酸变性时,吸光度升高,称为增色效应;当变性核酸重新复性时,吸光度又会恢复到原来的水平。较高温度、有机溶剂、酸碱试剂、
2、尿素、酰胺等都可以引起DNA分子变性,即DNA双链碱基间的氢键断裂,双螺旋结构解开也称为DNA的解螺旋。在细胞内,DNA能与蛋白质结合形成染色体,整组染色体则统称为染色体组。对于人类而言,正常的体细中含有46条染色体。染色体在细胞分裂之前会先在分裂间期完成复制,细胞分裂间期又可划分为:G1期-DNA合成前期、S期-DNA合成期、G2-DNA合成后期。对于真核生物,如动物、植物及真菌而言,染色体主要存在于细胞核内;而对于原核生物,如细菌而言,则主要存在于细胞质中的拟核内。染色体上的染色质蛋白,如组织蛋白,能够将DNA进行组织并压缩,以帮助DNA与其他蛋白质进行交互作用,进而调节基因的转录。脱氧核
3、糖核酸的结构DNA的结构: DNA的结构一般可划分为一级结构、二级结构、三级结构和四级结构四个水平。DNA是一种长链聚合物,组成单位为四种脱氧核苷酸,即腺嘌呤脱氧核苷酸(dAMP 脱氧腺苷)、胸腺嘧啶脱氧核苷酸(dTMP 脱氧胸苷)、胞嘧啶脱氧核苷酸(dCMP 脱氧胞苷)、鸟嘌呤脱氧核苷酸(dGMP 脱氧鸟苷)。而脱氧核糖(五碳糖)与磷酸分子借由酯键相连,组成其长链骨架,排列在外侧,四种碱基排列在内侧。每个糖分子都与四种碱基里的其中一种相连,这些碱基沿着DNA长链所排列而成的序列,可组成遗传密码,指导蛋白质的合成。读取密码的过程称为转录,是以DNA双链中的一条单链为模板转录出一段称为mRNA(
4、信使RNA)的核酸分子。DNA是由许多脱氧核苷酸按一定碱基顺序彼此用3, 5-磷酸二酯键相连构成的长链。大多数DNA含有两条这样的长链,也有的DNA为单链,如大肠杆菌噬菌体X174、G4、M13等。DNA有环形DNA和链状DNA之分。在某些类型的DNA中,5-甲基胞嘧啶可在一定限度内取代胞嘧啶,其中小麦胚DNA的5-甲基胞嘧啶特别丰富。在某些噬菌体中,5-羟甲基胞嘧啶取代了胞嘧啶。40年代后期,查加夫(E.Chargaff)发现不同物种DNA的碱基组成不同,但其中的腺嘌呤数等于其胸腺嘧啶数(A=T),鸟嘌呤数等于胞嘧啶数(G=C),因而嘌呤数之和等于嘧啶数之和,一般用几个层次描绘DNA的结构。
5、浓盐法从动物组织中提取DNA核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白(DNP/RNP)的形式存在,其中DNP能溶于水及高浓度盐溶液,但在0.14 M的盐溶液中溶解度很低,而RNP则可溶于低盐溶液,因此可利用不同浓度的NaCl溶液将其从样品中分别抽提出来。将抽提得到的DNP用SDS处理可将其分离DNA和蛋白质,用氯仿-异戊醇将蛋白质沉淀除去可得DNA上清,加入冷乙醇即可将其呈纤维状析出。肝脏细胞肝脏是由肝细胞组成,肝细胞极小,肉眼看不到,必须通过显微镜才能看到。人肝约有25亿个肝细胞,5000个肝细胞组成一个肝小叶,因此人肝的肝小叶总数约有50万个。肝细胞为多角形,直径约为20-30/加(微米),有6-
6、8个面,不同的生理条件下大小有差异,如饥饿时肝细胞体积变大。每个肝细胞表面可分为窦状隙面、肝细胞面和胆小管面三种。肝细胞里面含有许许多多复杂的细微结构:如肝细胞核、肝细胞质、线粒体、内质网、溶酶体、高尔基氏体、微粒体及饮液泡等组成。二、实验目的1.掌握浓盐法从动物组织中提取DNA的原理与技术三、实验原理核酸和蛋白质在生物体中常以核蛋白(DNP/RNP)的形式存在,其中DNP能溶于水及高浓度盐溶液,但在0.14 M的盐溶液中溶解度很低,而RNP则可溶于低盐溶液,因此可利用不同浓度的NaCl溶液将其从样品中分别抽提出来。将抽提得到的DNP用SDS处理可将其分离DNA和蛋白质,用氯仿-异戊醇将蛋白质
7、沉淀除去可得DNA上清,加入冷乙醇即可将其呈纤维状析出。四、实验器材和材料试剂实验器材: 匀浆器 量筒 离心机 离心管 试管 吸管 恒温水浴锅实验材料: 猪肝实验试剂: 0.1mol/L NaCl-0.05mol/L 柠檬酸钠溶液(pH6.8) 95%乙醇(A.R.) NaCl固体(A.R.) 5%SDS溶液(5g SDS 定容至100ml) V(氯仿):V(异戊醇)20:1的混合液五、实验操作1.称量称取一定质量的猪肝,加入2倍肝重的0.1mol/L NaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液并用匀浆器磨碎(已完成)。2.提取DNA量取肝糜4 ml 于10毫升离心管,在4000r/min下离
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