第十章家畜配子与胚胎生物工程.ppt

家畜配子与胚胎生物工程家畜配子与胚胎生物工程胚胎移植家畜胚胎移植概论胚胎移植的概念及基本操作过程胚胎移植在畜牧生产上的意义胚胎移植的生理学基础和原则l生理学基础l胚胎移植的基本原则胚胎移植的技术程序供体母畜和受体母畜的选择超数排卵供体母畜的配种胚胎的收集（手术法、非手术法）胚胎的评定(正常胚胎、形态异常胚胎)胚胎的保存和培养胚胎冷冻、移植具体操作体外受精技术体外受精l卵母细胞的采集和成熟培养l体外受精过程l精子的处理l受精方法l影响体外受精效果的因素l胚胎培养胚胎分割l 胚胎分割的方法l分割胚的发育l影响分割胚发育的因素l胚胎分割技术的应用核移植供体细胞的准备受核细胞的准备和去核去核移核细胞融合活化处理化学激活电激活重组胚移植转基因动物技术转基因动物技术转基因动物技术的发展简史转基因动物技术的应用与前景转基因动物技术存在的问题建立转基因动物的方法转基因动物的检测性别鉴定与性别控制性别鉴定与性别控制性别鉴定细胞遗传学方法H-Y抗原测定法SRY-PCR法性别鉴定性别控制免疫分离精子法用流式细胞分类仪分离精子胚胎移植(Embryo Transfer，ET)又称受精卵移植，是把一头雌性动物的早期胚胎从输卵管或子宫内冲洗出来，移植到另一头雌性动物的输卵管或子宫内，使之继续发育成新个体的技术。其中提供胚胎的动物称为供体（Donor），接受和孕育胚胎的动物称为受体(recipient)。胚胎移植的意义从根本上说就是缩短优良母畜的繁殖周期，增加一次生产后代的数量。因此与其相关的工作都会用到此项技术，例如家畜育种中对优良畜种的大量生产、对稀有品种的迅速扩繁等。同时由于家畜胚胎的可携带性，又使其可以代替活畜进口，由于胚胎不依赖于母畜的直接接触，这样就可以防止疾病的传播。母畜发情后生殖器官的孕向发育早期胚胎的游离状态胚胎移植与免疫排斥的影响胚胎的遗传特性胚胎移植前后所处环境的同一性分类学上的相同属性生理上的一致解剖部位的一致胚胎收集的期限胚胎的质量保证主要指母畜的生理状况。供体要具较高的育种价值、对超数排卵反应良好。受体要具有良好的繁殖性能、体型要大。方法的改进：方法的改进：1 1、PMSGPMSG方面方面 2 2、FSHFSH方面方面 3 3、其他方面其他方面抗冷冻保护剂抗冷冻保护剂胚胎冷冻的主要方法胚胎冷冻的主要方法n控温冷冻保存控温冷冻保存n玻璃化冷冻玻璃化冷冻抗冷冻保护剂抗冷冻保护剂胚胎冷冻所用的保护剂主要分为三类：(1)渗透性的：丙三醇、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺等；(2)非渗透性的：葡萄糖、聚蔗糖、葡聚糖、牛血清白蛋白(BSA)、胎牛血清(FCS)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等；l l 卵母细胞的采集和选择卵母细胞的采集和选择体外成熟的判定体外成熟的判定影响卵母细胞体外成熟的因素影响卵母细胞体外成熟的因素l l 卵母细胞的培养卵母细胞的培养卵母细胞的体外成熟培养系统卵母细胞的体外成熟培养系统W W基础培养体系基础培养体系W W腔前卵泡体外成熟培养系统腔前卵泡体外成熟培养系统l发育阻滞现象l体外培养体系 合成液培养系统 共同培养系统方法之一：解剖显微镜下观察卵丘细胞是否扩展松散,扩展好的，一般认为是已成熟的卵母细胞。方法之二：是用吸管吹打法或透明质酸酶分解法除去卵丘细胞，以观察在卵周隙中是否有第一极体，但要观察第次减数分裂(M)中期的核，需制片染色。方法之三：采集的卵母细胞绝大部分与卵丘细胞形成卵丘卵母细胞复合体。任何方法采集的COC都要求卵母细胞形态规则，细胞质均匀，外围有多层卵丘细胞紧密包围(图示1、图示2）。影响卵母细胞体外成熟的因素A.动物的种类不同；动物的种类不同；B.卵母细胞类型；卵母细胞类型；C.卵泡直径与卵母细胞体外成熟能力有关；卵泡直径与卵母细胞体外成熟能力有关；D.卵母细胞离体操作的时间和条件；卵母细胞离体操作的时间和条件；E.采卵季节有关；采卵季节有关；基础培养液以合成培养液如TCMl99应用最多。缓冲体系以Hepes或碳酸氢盐缓冲系(Earles Salts)为好，而磷酸盐缓冲系(Hanks)较差。培养条件是5CO2、95空气饱和湿度，多采用微滴法(100L,l015个卵母细胞)。添加犊牛血清、发情牛血清、胎牛血清、发情山羊血清或牛血白蛋白(BSA)等。使用浓度510，BSA浓度35mgmL添加促性腺激素，主要有HCG或PMSG、FSH+LH。添加雌激素对卵母细胞体外成熟的影响尚存分歧。添加发情牛血清、发情山羊血清时，主张无激素培养法。基础培养液中添加卵泡液(BFF)、颗粒细胞或中糖卵管上皮细胞利于卵母细胞体外成熟。培养腔前卵泡培养基主要有MEM,GMEM,TCMl99和Wavmouth MB752/l 培养基等。培养基中添加血清、成熟分裂抑制剂、促性腺激素、类固醇激素和生长因子等。培养方法有微滴法、琼脂包埋培养法、胶原蛋白铺层培养法(二维法)和胶原蛋白包埋培养法(三维法)。分离培养腔前卵泡研究已在小鼠、仓鼠、大鼠、兔、猫、猪和牛均有报道，并以小鼠和牛研究较多，但仅在小鼠获得后代。l精子的预处理精子的预处理浮游程序（浮游程序（swim up）玻璃棉过滤程序玻璃棉过滤程序BSA/Percoll 密度梯度密度梯度透明质酸的作用透明质酸的作用精子洗涤精子洗涤精子浓度精子浓度l精子活力的提高精子活力的提高咖啡因咖啡因PHE腺苷及其类似物腺苷及其类似物血小板激活因子血小板激活因子谷胱甘肽谷胱甘肽己酮可可碱和茶碱己酮可可碱和茶碱l体外获能处理方法体外获能处理方法肝素处理肝素处理高离子强度液处理高离子强度液处理高高pH pH 值处理值处理黄嘌呤黄嘌呤咖啡因处理咖啡因处理牛卵泡液牛卵泡液猪卵泡液猪卵泡液子宫液、输卵管液子宫液、输卵管液精子活力激动剂精子活力激动剂钙离子载体处理钙离子载体处理调整获能精子浓度，制成小滴，覆盖石蜡油，经培养3060min。将体外培养成熟的卵母细胞加入与之共孵育。精卵共孵育时间与受精体系有关。洗去多余精子和卵丘细胞，转移至受精卵培养液中继续培养。受精卵标志是雌、雄原核，排出第二极体，或发育到卵裂期胚胎。显微受精(micro fertilization)。它是利用显微操作仪将精子直接注入卵母细胞内，使精卵结合的生命过程，已在小鼠、兔、牛和人类取得成功并获得后代。%卵母细胞的来源和成熟状态；%精子来源和密度、精子的活力；%培养基的选择；%受精滴的大小；%精卵比例；%精卵相互作用时间、湿度、温度和气相等；利用成分确定的合成液：添加血清、BSA、维生素和氨基酸、丙酮酸钠等物质，便于研究 发育过程中某一种物质对胚胎的作用机制，有助于了解胚胎早期发育和代谢机理，但囊胚发育率不高。分步培养法：根据胚胎发育不同生长阶段对不同物质和代谢不同，采用不同培养液进行培养，包括含血清和或BSA的蛋白培养体系和无蛋白培养体系。屠宰场收集的牛卵母细胞经体外培养至成熟，体外受精得到受精卵采用半确定培养液两步培养系统其桑椹胚发育率高达50。利用辅助细胞或饲养细胞(主要有输卵管上皮细胞、颗粒卵丘细胞、子宫内膜细胞、肾细胞、成纤维细胞和水牛、大鼠肝细胞BRL等)在体外与受精卵共同培养促进胚胎发育可得较高的囊胚发育率。共同培养中仍存在选择何种体细胞最适宜，是否存在特异性或非特异性胚胎生长因子等。由于体细胞的加入，使培养液成分更加复杂，很难从中分析出影响培养效果的具体因素，而且胚胎和体细胞对培养的各种条件要求不一，故尚未有令人满意的结果。毛细管吹吸法毛细管吹吸法显微手术法显微手术法徒手分割法免疫手术法l 2-细胞到8-细胞分割胚的发育l 桑椹期和囊胚期分割胚的发育l l胚胎分割的时期胚胎分割的时期l l胚胎的分割程度胚胎的分割程度l l透明带的有无透明带的有无l l分割胚的培养条件分割胚的培养条件l l胚胎性别胚胎性别l l移人受体的胚胎数移人受体的胚胎数l l分割胚的保存分割胚的保存l胚细胞核移植l构建异源重构胚胎l研究遗传-环境相互作用l l产生嵌合体产生嵌合体l l产前诊断产前诊断l l提高体外受精的妊娠率提高体外受精的妊娠率这种方法主要适用于分离2-细胞到8-细胞期卵裂球。在显微操作仪的帮助下，在无钙、镁离子的培养液中，用固定针吸住胚胎，用另一玻璃针挑开胚胎的透明带，细胞团自透明带中脱出。再用仅能通过胚胎的毛细管吹吸胚胎，得到单个卵裂球，再将卵裂球装入空的透明带中，体外培养至一定时期，移植入受体中。这种方法主要适用于分割桑椹胚和囊胚。在显微操作仪的帮助下，以固定针吸住胚胎，用玻璃针或显微手术刀将胚胎对称切割。在切割桑椹胚时，需在不含钙、镁离子的培养液中，以降低细胞间的连接，降低由于切割造成的损伤。对胚胎的分割要注意对称，尤其是囊胚，要注意将内细胞团对称地一分为二。徒手分割法主要适用于分割体积较大的胚胎，其优势在于可以不用显微操作仪。在立体显微镜下，用止血钳夹住切割刀片，将透明带切开一部分，再用直径略小于胚胎的毛细管吹吸几次，胚胎从透明带中脱出。手持玻璃针自上而下对称切割裸胚。这种方法多用于分割桑椹胚和囊胚。免疫手术法利用处于囊胚期的胚胎其滋养层细胞之间已形成紧密连接，能阻挡外部抗体分子进入囊胚腔。方法：将胚胎置于抗血清中，使滋养层细胞与抗体分子充分结合，然后在补体的协助下，利用免疫反应，溶解外层的滋养层细胞，而未结合抗体分子的内细胞团则保持完整。这样分离的内细胞团可注射人另一胚胎的囊胚腔中，或与处于桑椹期的其他胚胎整合，这样可产生嵌合体。对早期胚胎细胞，先用1%的链酶蛋白酶或pH2.5的台氏液去掉透明带，再用机械吹打或酶消化法使其分散为单个游离的卵裂球。体细胞经0.25%胰蛋白酶消化后，将细胞接种培养于DMEM/F12培养中。后放入5%CO2培养箱中培养，待细胞长至70%-80%时传代3-8代时用于核移植。核移植操作前3-5 d，将培养基中的血清浓度降至0.5%进行饥饿，使其处于G0期。但对血清饥饿是否必需还未定论。l 透明带切开法(两步法)透明带切口透明带切口去核去核l 一步法HochestHochest染色去核法染色去核法时间控制去核法时间控制去核法化学去核法化学去核法2.5%2.5%蔗糖处理去核法蔗糖处理去核法末期去核法末期去核法l 带下移植l 胞质内注射l 化学融合l 仙台病毒(H1V)融合l 电融合l l7%乙醇l l离子霉素l lA23187l l6-DMAPl lStaurosporinel lSrCl2融合时将待融合卵先经融合液处理，3-5min后移人电融合槽中。用人工或交流电使待融合卵定位。不同动物所用的刺激强度不同。电刺激后，尽快把重构卵移出，新鲜培养液中洗3次后，培养2030 min检查融合情况。检查方法有：观察供体细胞和受体细胞的接触面是否已消失。供体核是否已进入卵母细胞，这是最明确的证据；采用Hochest 33342染色，荧光下观察供体核物质是否进入受体胞质中；检查透明带下卵周隙是否存在退化或被损坏的供体细胞碎片。电激活根据其在核移植前或后进行而分为前激活融合激活和后激活。电激活一般采用强度100V/mm，持续时间为50-80s的一个直流脉冲即可。在实际应用中，应考虑不同动物卵母细胞的卵龄和MPF下降水平的关系，选择合适的时间进行核移植以获得良好的效果。最近，Loi等(1998)证明，采用离子霉素激活后再用6-DMAP处理3h，可避免出现早熟染色体凝集(PCC)，并且明显增加羊重构胚的发育率及出生率。l 基因表达和调控的研究l 转基因动物模型l 转基因动物生物反应器l 转基因改良移植器官l 改良动物品种l 转基因动物的效率较低l 转基因表达的混乱l 转基因对宿主动物的影响l 显微注射法l 胚胎干细胞法l反转录病毒载体法l精子载体法 DNA DNA的制备及其对转基因效率的影响的制备及其对转基因效率的影响 酶解、分离与抽提、氯化铯离心酶解、分离与抽提、氯化铯离心 收集收集DNADNA溶液、透析与定量溶液、透析与定量 缓冲液的配制缓冲液的配制 受精卵的获取受精卵的获取 显微注射显微注射 注射卵的移植注射卵的移植 输卵管移植、子宫移植输卵管移植、子宫移植l 胚胎干细胞的培养l ES细胞的基因组操作l ES细胞的子宫转移l 反转录病毒的增殖与整合l 反转录病毒载体的构建l 反转录病毒的感染与导入l 精子对外源精子对外源DNADNA摄取摄取l 精子与外源精子与外源DNADNA作用方法作用方法n n 混合培养法混合培养法n n 电穿孔法电穿孔法n n 脂质体介导法脂质体介导法l 精子与外源精子与外源DNADNA结合部位结合部位l 影响精子与影响精子与DNADNA结合的因素结合的因素l 基因组DNA的提取l 目的基因的整合检测l 外源基因整合位点的检测斑点印迹(spot blot)法Southern印迹(Southern blot)法聚合酶链反应(PCR)染色体原位杂交(in situ hybridization)法转录水平的检测nNorthernNorthern印迹印迹(Northern blot)(Northern blot)法法n反转录酶反转录酶-聚合酶链反应聚合酶链反应(RT-PCR)(RT-PCR)法法nRNaseRNase保护分析保护分析蛋白质水平的检测n免疫印迹免疫印迹(Western blot)(Western blot)法法n其它方法其它方法l 胚胎细胞毒性分析l 间接免疫荧光分析法l 囊胚形成抑制法l免疫亲和柱层析法lH-Y抗血清直接输入法l免疫磁珠技术