DB15T+2833-2022狼源性成分检测 实时荧光PCR法.pdf
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1、 ICS 67.120.01 CCS B 45 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 28332022 狼源性成分检测 实时荧光 PCR 法 Real-time PCR method for detection of canis lupus-derived materials 2022-12-08 发布 2023-01-08 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由中华人民共和国呼和浩特海关提出并归口。本文件起草单位:中华人民共和国二连海关。本文件主要起草人:王伊琴、陈少博、包
2、勇敢、杨帆、荆文魁、苏日娜、张志峰、常鸿、寇福军、赵治国。狼源性成分检测 实时荧光 PCR 法 1 范围 本文件规定了动物源性产品中狼源性成分实时荧光PCR检测方法。本文件适用于动物源性产品(肉制品、皮毛制品、饲料等)中狼源性成分的鉴定,灵敏度为0.15ng/L。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 27403 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 3 术语和定义 下列
3、术语和定义适用于本文件。实时荧光 PCR real-time PCR 在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累实时监控整个PCR扩增过程。Ct 值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyl trithyl ammonium bromide)DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonuleic acid)EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid)FAM:6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein)PC
4、R:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction)TAMRA:羧基四甲基罗丹明(carboxy-tetramethyl-rhodamine)Tris:三(羟甲基)氨基甲烷tris(hydroxymethyl)aminomethane 5 试剂与材料 水:符合 GB/T 6682 的要求。引物对序列:a)上游:5-CCGTACTCTAGCTTACATA-3;b)下游:5-GAGACCTTCCAGATGAAA-3;c)探针序列:5-(FAM)-TACCTCACATTAGCCAAGAAGCCA-(TAMRA)-3。DNA 提取试剂盒。CTAB。Tris-HCl(pH 8.0)。
5、NaCl。EDTA。蛋白酶 K 溶液(20 mg/mL)。三氯甲烷。异丙醇。75%乙醇。实时荧光 PCR 预混液。阳性对照样品:采用已知含有狼源性成分样品的 DNA,或经测序确认的阳性质粒。见附录 B。阴性对照样品:采用已知不含有狼(包括其他犬科动物)源性成分样品的 DNA。空白对照:ddH2O。6 仪器与设备 实时荧光 PCR 仪(加热速率 10/s 以上)。高速台式离心机(最高转速 12000 rpm)。旋涡振荡器(最高转速 3000 rpm)。核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。恒温水浴锅。天平(感量 0.01 g)。单孔道微量移液器:0.5 L10 L、10 L100 L、20 L200
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