DB15T+2855-2023马铃薯腐烂茎线虫的qPCR检测技术规程.docx
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1、ICS65.020.01CCSB 3115内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准DB15/T 28552023马铃薯腐烂茎线虫的 qPCR 检测技术规程Code of practice for qPCR detection of ditylenchus destructor2023-01-28 发布2023-02-28 实施内蒙古自治区市场监督管理局发 布前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会(SAM/TC 20)归口。本文件起草单位:内蒙古自治区农牧业科学院
2、、中国农业大学、鄂尔多斯市农牧技术推广中心、内蒙古自治区农牧业技术推广中心、鄂托克前旗农牧业技术推广中心。本文件主要起草人:席先梅、张力群、霍宏丽、陈伟、苗春乐、融晓君、路奇、尤俊文、张晓霞、贺小勇、孔庆全、张冬梅、田晓燕。马铃薯腐烂茎线虫的 qPCR 检测技术规程1 范围本文件规定了利用qPCR检测技术对马铃薯腐烂茎线虫检测的试剂、仪器、样品处理、DNA提取、结果记录和样品保存等内容。本文件适用于土壤和马铃薯植物样品中腐烂茎线虫的qPCR检测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的
3、引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法NY/T 1121.1 土壤检测 第1部分:土壤样品的采集、处理和储存3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。腐烂茎线虫 ditylenchus destructor腐烂茎线虫属于线虫门(Nematoda)、侧尾腺纲(Secernrntea)、垫刃目(Tylenchida)、粒科(Anguinidae)、茎线虫属(Ditylenchus),是危害马铃薯的重要病原线虫,可引起马铃薯叶片黄化、萎蔫、块茎干腐等症状,导致减产和品质降低。参见附录A。定 量 PCR quantitative PCR定
4、量PCR技术(quantitative PCR,qPCR)是指在PCR反应体系中加入可与靶标DNA结合的荧光基团,依据荧光信号的强度对扩增产物进行实时监测,从而实现对初始靶标DNA模板量进行定量分析的技术。根据荧光信号来源可分为染料法和探针法。4 试剂和仪器试剂4.1.1 除特别规定外,所有实验用试剂均为分析纯,实验用水应符合 GB/T 6682 中相关规定。4.1.2 土壤提取缓冲液:1 M Tris-HCl,0.1 M EDTA,1.5 M NaCl,2% CTAB,0.1 M NaH2PO4/Na2HPO4, pH=8.0。4.1.3 CTAB 缓冲液:2% CTAB,1.4 M NaC
5、l,0.1 M Tris-HCl,0.02 M EDTA,pH=8.0。E 缓冲液:10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA,pH=8.0。4.1.4 TE 缓冲液:10 mM Tris-HCl,1 mM EDTA,pH=8.0。4.1.5 其他试剂包括Tris 饱和酚(pH=7.8),氯仿,异丙醇,无水乙醇,70%乙醇,20% SDS,rTaq DNA 聚合酶(5 U/L)及其缓冲液,25 mM 氯化镁(MgCl2)溶液,dNTPs 溶液(含 dATP, dTTP, dCTP, dGTP 各 2.5 mM),0.1%牛血清蛋白(bovine serum albumin,BSA)。仪器
6、超微量分光光度计,真空抽干仪,普通天平(感量0.01 g),高速离心机,4 冰箱,医用冰箱(-20 ),超低温冰箱(-80 ),制冰机,水浴锅,涡旋振荡仪,磁力搅拌器,高压灭菌锅,定量荧光PCR仪,金属浴,超净工作台,pH计,移液器(2 L,10 L,20 L,100 L,200 L,1000 L),土壤取样器(内径小于等于2 cm),研钵及研杵,土壤粉碎机。材料离心管(1.5 mL,2 mL,50 mL),PCR管(200 L),吸头(10 L,200 L,1000 L),量筒(50 mL)。5 样品处理及 DNA 提取 土壤样品采集、前处理及 DNA 提取5.1.1 土壤样品采集土壤样品采
7、集方法采用NY/T 1121.1。取样时应使用内径小于等于2 cm的土壤取样器,取样深度为15 cm20 cm,“W”型取样15点20点,每份土样重量以500 g1000 g为宜。5.1.2 土壤样品前处理土壤样品采集后应及时进行干燥处理,可于室内环境自然风干,风干过程中避免阳光直晒和高温高湿环境。此外,土壤样品也可于干燥箱中(40 )进行24 h烘干。去除土壤样品中的石块,沙砾,塑料薄膜等成分,保留植物组织,使用土壤粉碎机破碎干燥土壤样品。使用翻拌法对土壤样品进行混匀,即使用玻璃棒或塑料棒将土样平铺于玻璃板或纸张上,用铲子进行对角翻拌,重复20次以上。混匀后的土壤样品密封后于阴凉干燥处保存。
8、每份样品处理完毕后需对土壤粉碎机,玻璃棒和玻璃板等仪器工具进行清洗和消毒以避免样品间交叉污染。5.1.3 土壤样品 DNA 提取取6.2.2中经前处理的土壤样品,按照四分法进行取样,将土样平铺于塑料薄膜或纸张上,呈四方形,根据对角线将土样分成四份,对角两份分别合并为一份,取其中一份继续进行四分法,直到获得所需数量为止。每份土样取3个重复,每个重复取10 g土样于50 mL离心管中,加入20 mL土壤提取缓冲液,涡旋震荡使之充分混匀,取1.2 mL土壤悬浮液于2 mL离心管中,加入300 L 20% SDS溶液,涡旋混匀后于65 水浴2 h,期间每10 min颠倒混匀一次,水浴完毕后12000
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