DB22-T3440-2023人粪便中华支睾吸虫虫卵检测 PCR和实时荧光PCR法.docx
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1、ICS07.00.01CCSC 6222吉林省地方标准DB 22/T 34402023人粪便中华支睾吸虫虫卵检测 PCR 和实时荧光 PCR 法Detection of Clonorchis sinensis eggs in human feces-PCR and real time PCRmethods2023 - 01 - 13 发布2023 - 03 - 01 实施吉林省市场监督管理厅发 布目次前言II1 范围12 规范性引用文件13 术语和定义14 缩略语15 试剂、材料和引物1 试剂1 材料2 引物26 仪器和设备27 样品采集38 核酸提取39 DNA 的浓度和纯度测定3 普通 P
2、CR 检测4 实时荧光 PCR 检测5附 录A (资料性) 试剂配制6附 录B (规范性) 华支睾吸虫虫卵特定的 DNA 序列710 PCR 检测4前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由长春海关提出并归口。本文件起草单位:吉林国际旅行卫生保健中心(长春海关口岸门诊部)、长春海关技术中心。本文件主要起草人:马文晨、孟庆峰、赵大力、王玮琳、刘金华、孟日增、王伟利。人粪便中华支睾吸虫虫卵检测 PCR 和实时荧光 PCR 法1 范围本文件规定了人粪便中华支睾
3、吸虫虫卵PCR和实时荧光PCR法的试剂、材料和引物,仪器和设备,样品采集,核酸提取,DNA 的浓度和纯度测定,检测方法和结果判定。本文件适用于人粪便中华支睾吸虫虫卵核酸检测。2 规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件, 仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4 缩略语下列缩略语适用于本文件。bp:碱基对(base pair)CTAB:十六烷基三甲基溴化铵(cetyltrithylam
4、monium bromide) DNA:脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)dNTP:脱氧核苷酸三磷酸(deoxyribonucleoside triphosphate) EDTA:乙二胺四乙酸(ethylene diaminetetraacetic acid) FAM:6-羧基荧光素(6-carboxyfluorescein)OD:光密度值(optical density)PCR:聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) Taq 酶:DNA 聚合酶(thermus aquaticu)TE 缓冲液:Tris-HCl、EDTA 缓冲液(Tris-
5、EDTA buffer solution)Tris:三(羟甲基) 氨基甲烷tris (hydroxymethyl) aminomethane MGB:小沟结合物(minor groove binder)5 试剂、材料和引物 试剂5.1.1 除另有规定外,试剂为分析纯或生化试剂。试验用水应符合 GB/T 6682 中一级水的规定。5.1.2 液氮。5.1.3 EDTA 缓冲液(0.5 mol/L、pH 8.0)。5.1.4 CTAB 提取缓冲液(2.0%)。5.1.5 CTAB 沉淀液(0.5%)。5.1.6 蛋白酶 K 溶液(20 mg/mL)。5.1.7 NaCl 溶液(1.2 mol/L)
6、。5.1.8 三氯甲烷。5.1.9 三氯甲烷/异戊醇(24:1,V/V)。5.1.10 异丙醇。5.1.11 70% 乙醇。5.1.12 TE 缓冲液。5.1.13 加样缓冲液。5.1.14 Golden View 核酸染料(或其他等效核酸染料)。5.1.15 Premix Taq 反应预混液(市售商品化 PCR 基础试剂)。5.1.16 Premix Ex Taq(Probe qPCR)(2)反应预混液(市售商品化荧光 PCR 基础试剂)。5.1.17 琼脂糖凝胶。5.1.18 1TAE 电泳缓冲液。 试剂配制材料5.3.1 无 DNA 酶污染的离心管(1.5 mL、2.0 mL)。5.3.
7、2 PCR 反应管。5.3.3 无 DNA 酶污染的吸头(10 L、100 L、200 L、1 000 L)。引物5.4.1 普通 PCR 引物序列见表 1。表1 普通 PCR 引物序列5.4.2 实时荧光 PCR 引物与探针序列见表 2。表2 实时荧光 PCR 引物、探针序列6 仪器和设备试剂配制参见附录 A。名称序列片段大小上游引物5-TTGTCTGGGTAGGGTGGTTTG-3231 bp下游引物5-ACTATCCCAGTAACCCCGCC-3名称序列上游引物5-TATAGTTTGTCTGGGTAGGGTGGTT-3下游引物5-AACAGCAGTCCCCAAATCCA-3探针5-FAM
8、-AGCTCATCATATGTTTACTG-MGB-3 PCR 仪。 实时荧光 PCR 仪。 电泳仪。 凝胶成像系统。生物安全柜。 离心机(离心力不小于 12 000 g)。 核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计。 移液器(2.5 L、10 L、20 L、100 L、200 L、1 000 L)。 研钵或冷冻粉碎装置。 恒温水浴锅或干式恒温器。天平(感量 0.01 g)。 高压灭菌器。7 样品采集采集人体粪便,避免污染。样品应 -20 保存,冷藏运输,不能在 24 h 内送达实验室的样品应冷冻状态运送。8 核酸提取 在生物安全柜内取 200 mg500 mg 黄豆粒大小粪便,在液氮中充分研磨;或使用
9、组织研磨仪对样品进行充分地研磨。取研磨后的样品 200 mg 于 2.0 mL 离心管中,加入 1.5 mL CTAB 提取缓冲液(2.0%)和 10 L 蛋白酶 K 溶液,65 孵育 30 min,期间每隔 10 min 振荡混匀;12 000 g 离心 10 min,转移上清于洁净的离心管中。加 750 L 三氯甲烷/异戊醇,混匀,12 000 g 离心 5 min,转移上清液于洁净的离心管中。 加 2 倍体积 CTAB 沉淀液(0.5%),室温静止 60 min,12 000 g 离心 15 min,弃上清。加入 350 L NaCl 溶液将沉淀重悬浮。再加入 350 L 三氯甲烷,旋涡
10、振荡进行混匀,12 000 g 离心 10 min。 转移上清后加入 0.6 倍体积的异丙醇用来沉淀核酸,室温放置 20 min,12 000 g 离心 10 min, 弃上清。加入 500 L 70% 乙醇洗涤一次,晾干。加入 100 L TE 缓冲液或超纯水,溶解沉淀。立即使用或 20 保存备用。 可使用等效的商品化 DNA 提取试剂盒,按操作说明书进行操作。9 DNA 的浓度和纯度测定 样品 DNA 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测定 260 nm 和 280 nm 处的吸光值 A260 和A280。 DNA 的浓度按式(1)进行计算:式中:c = AN50(1)c DNA 浓度,
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