药学专业-—外文翻译学士学位论文.doc

本科毕业论文(设计)外文翻译
学 院

专 业
药学
姓 名

学 号

指导老师

职 称

合作老师

职 称

外文题目（原文）
Transgenic plants as factories for
biopharmaceuticals
译文：
转基因植物——生物医药的生产工厂

Glynis Giddings*, Gordon Allison, Douglas Brooks, and Adrian Carter
Institute of Biological Sciences, University of Wales, Aberystwyth, Cledwyn Building, Aberystwyth Ceredigion SY23 3DD, UK. *Corresponding author ([e-mail]).

Received 12 November 1999; accepted 11 August 2000

由于容易转化且能为蛋白质提供廉价来源，植物在蛋白质和多肽等生物药物生产中具着巨大潜力。在第一个植物来源的生物药物正在进行临床试验的同时，许多生物技术公司正积极开发，进行大田试验，并获得植物表达系统的专利。水蛭素是一个转基因植物生物药品，目前首次在加拿大进行了商业化生产。但产物的纯化是一昂贵的过程，目前开发了多种方法解决这个问题，包括油体膜蛋白融合技术，使提取油体的方法获得目的蛋白。在某些情况下，我们可以利用直接消化经修饰的植物来进行生物制药产品的给药，这种情况下，就可能消除对纯化步骤的需要。这种生物药品和可食疫苗可以存储和分布在种子，块茎，或水果中，使得发展中国家的管理部分可以更便宜和容易实施免疫计划。通过转基因植物生产可以使一些如葡糖脑苷脂酶等有限使用的昂贵生物药品，变的又多又便宜。

关键词：生物药物，转基因作物，可食疫苗，抗体，生产系统

传统上使用各种转基因系统来生产生物药物，包括培养的哺乳动物细胞、细菌和真菌系统。在未来，预计将需要大量的现有的生物药物（如用于治疗贫血症的促红细胞生成素和治疗糖尿病的胰岛素），以及通过基因组学发现的新的治疗蛋白因此要谨慎的评估可替代的转基因生产体系，并确定在符合成本效益下如何在未来提供安全的重组生物药品。用植物生产治疗性蛋白质有许多经济和质量上的优势，包括减少因病菌污染带来的健康风险，相对较高的产量和以种子或其他贮藏器官进行生产。转基因作物的种植，收获，储藏，加工可以使用现有的基础设施，所需资金投入较少，使生物制药商业生产有着令人兴奋的前景。植物是一个潜在的价廉物美的重组产品的来源：Kusnadi等估计，在大肠杆菌发酵生产相同的蛋白质的成本是利用不同作物生产重组蛋白的10-50倍。
许多基因重组治疗性蛋白质都采用了哺乳动物表达系统。昆虫组织培养系统的一个很大的优势，是能正确地合成和加工哺乳动物的产品。但是，产品的产量普遍偏低,胎牛血清在培养基中的使用使生产成本很高。此外，在工业化生产过程中培养的哺乳动物细胞对剪切力，以及温度，pH，溶解氧的变化，以及某些代谢产物很敏感。这就需要严格控制培养条件，因为变异细胞的增长会影响发酵和产品纯度。尽管细菌和真菌系统更强大，但由于他们在代谢途径，蛋白加工，密码子使用，形成包涵体上有许多差异，所以不是合成哺乳动物蛋白的理想系统。虽然植物和动物在翻译后加工和密码子之间存在一些差异，但与哺乳动物和微生物之间的差异相比只很少的差异。在处理问题时哪里出现了一些不同，都可能使工程株改变蛋白质的成熟途径。
细胞培养系统中生产的生物药品需从培养上清中进行纯化，这是一个昂贵的纯化过程。植物种子胚乳中可以很容易的提取出蛋白质。不过，纯化可能是一种昂贵的步骤，但正在制定各种方法来解决这个问题，包括与油体融合表达蛋白（见下面的水蛭素的讨论）。另一种方法是将提取传统的产品来减少纯化成本，如粗粉，油，淀粉。例如，从马铃薯淀粉分离人血清白蛋白的费用在很大程度上可以靠淀粉生产。此外，纯化可能并不总是必要的，例如可食性疫苗的生产。植物性产品，无论纯化与否，都不太可能被那些从动物细胞衍生的人类致病微生物污染，因为植物不是人类传染性病原体宿主。
在这短短的综述中，我们概述了农业生产中用于生物制药的植物表达系统的主要类型，并对疫苗，抗体类型，以及正在开发的治疗蛋白产品（对植物组织培养生产的外源蛋白综述，见（ref. 14）进行概述。

农业生产系统
通常使用两种转化方法在植物里生产重组药品。第一种利用农杆菌稳定转化，基因枪法，或其他标准的转化技术来生产转基因植物。烟草被广泛用作模型表达系统，其他一些植物也已被使用，其中包括烟草，拟南芥，番茄，香蕉，萝卜，豇豆（黑眼豆），油菜，埃塞俄比亚芥菜，马铃薯，水稻，小麦和玉米。

第二种是当重组病毒在非转基因植物宿主中表达和复制时感染非转基因植物。最常用的主要病毒系统是烟草花叶病毒（TMV）和豇豆花叶病毒（CPMV）。虽然产量类似于转化植株，但他们产量可以更高。烟草花叶病毒衍生载体已被用于在番茄和烟草生产口服降血压肽（血管紧张素1转换酶抑制剂），以及在N.bethamiana中生产艾滋病毒抑制剂（α-天花粉蛋白）。嵌合CPMV颗粒，显性人类鼻病毒- 14和HIV - 1，已从转基因豇豆植物中分离出来。他们被发现可以在艾滋病毒嵌合体的情况下引起抗体的产生，以消除在体内由HIV - 1病毒感染的T细胞。第二种方法对于疫苗生产可能是很有用的。疫苗可以防范疾病，保护机体，他们通过刺激胃肠道的相关淋巴组织来促使免疫球蛋白A的产生。进入病毒颗粒、或将其和病毒蛋白链接的抗原表位的表达促进这一进程。
转基因植物药物蛋白的表达主要是由组成型CaMV 35S启动的。然而，可能会导致低产量，例如，人血清白蛋白占可溶性总蛋白的0.02%（TSP）和人类蛋白C为0.001％（见13）。种子限制表达可以带来更高的产量。种子表达的脑啡肽，例如，TSP可以累积到2.9％。种子的表达已通过外源基因引入谷蛋白（GT3）信号肽序列和Gt3启动子作用下转录实现了。在烟草中转基因免疫球蛋白的转录也由种子特异性，发育调节， 豆素B4的启动子控制。由于在细胞质中免疫球蛋白经常干扰细胞的功能，最好是将它们分泌到非共质体系，或定位到内质网处，在那里他们积累到更多比例（1-5％）。定位可通过豆球蛋白 B4的信号序列实现。
虽然由于上述生产系统易转化、易于应用它们已被广泛应用于研究和验证概念的研究，但并不是用于商业或其他大鬼魅应用的理想选择。从这些植物分离纯化重组蛋白将是低效和昂贵的，而且需要去除各种代谢物，包括尼古丁。此外，种子只占烟草植物中很一小部分比重，将必须使用营养组织。商业生产中从含水高的组织中提取蛋白质可能导致蛋白质的损失，而且降低了处理效率导致成本上升。基于这些原因，烟草可能仅被用来生产成本非常昂贵的生物药品。
投入到大规模商业生产可能包括谷物和油籽作物，如玉米，水稻，小麦，大豆，和油菜。贮存在种子的蛋白质变得干燥，并可长期保持完整，使得种子成为可以长期储存、管理生物制药，例如疫苗管理的方便的方法。提取和纯化是必要的，现在是破碎和碾磨分次提取，如粗粉和油，可用于提取重组产品。从植物组织或其它可用的作物如马铃薯淀粉上分离纯化重组蛋白，或嵌合病毒颗粒是经济可行的方法。

疫苗
植物基因现在已经被修饰，在病原体的抗原表位肽的基础上，产生对人类和动物疾病各种疫苗（表1）。ProdiGene生物制药公司（Station学院，德克萨斯州）最近进行的临床试验的表明，给猪食用转基因玉米生产的疫苗可预防猪传染性胃肠炎病毒对他们的感染。该公司已申请了一项用转基因植物生产该疫苗和其他人类和动物的疫苗的专利。
目前疫苗研制生产的一个重要目标是治疗引起慢性肝病的持续性血症的B型肝炎。第一个商用重组疫苗在考虑到血清抗原衍生的安全问题后已经在酵母中生产。在许多地方，费用，再加上设施（如冷藏设施）的缺乏已禁止使用重组疫苗了。1992年，世界卫生组织（日内瓦）和其他一些慈善组织集团开始了儿童疫苗倡议。
作出这一努力的有Thanavala等。最初开发的转基因烟草，然后是可以表达乙肝表面抗原的土豆。他们希望通过最大限度地使用未经处理的可食用植物组织中的免疫原性来为发展中国家生产疫苗。他们最近表明，口服乙肝表面抗原的转基因马铃薯的小鼠可引起体液免疫反应。最终，注意力集中在香蕉上，香蕉广泛生长于发展中国家，而相比于土豆，可以生吃。香蕉疫苗，其粉碎物，只需花费传统疫苗价格的一小部分。在未来，可以针对疾病；来生产香蕉疫苗，包括麻疹，脊髓灰质炎，白喉，黄热病，以及某些类型的病毒性腹泻。

表1:转基因植物生产的疫苗
可能的应用或适应症
植物
蛋白质
表达系统
参考
乙型肝炎
烟草
重组乙肝表面抗原
AMT
15,40

烟草
鼠肝炎表面抗原
TMV
36
龋齿
烟草
变形链球菌表面蛋白SpaA
AMT
15
自身免疫性糖尿病
土豆
霍乱弧菌肠毒素B亚基融合人胰岛素
AMT
44

土豆
谷氨酸脱羧酶
AMT
29
霍乱和大肠杆菌腹泻
烟草/土豆
肠杆菌不耐热肠毒素LT- B
AMT
15,45
防霍乱口服疫苗
土豆
霍乱弧菌毒素CtoxA和CtoxB亚基
AMT
49
无佐剂粘膜疫苗
豇豆
金黄色葡萄球菌纤维连接蛋白B D2肽
CPMV
38
诺沃克病毒性腹泻
烟草/土豆
诺沃克病毒外壳蛋白
AMT
30
狂犬病
烟草/菠菜
狂犬病病毒糖蛋白
AMT
22
艾滋病毒
烟草/豇豆
艾滋病毒表面抗原（gp120）
CPMV/AMT
14,35

豇豆
艾滋病毒表面抗原(gp41)
CPMV
38
鼻病毒
豇豆
人类鼻病毒抗原表位(HR14)
CPMV
15
手足口病
豇豆
手足口病毒抗原表位(VP1)
CPMV
15,36
抗貂肠炎病毒，犬细小病毒，猫泛白细胞减少症病毒
豇豆
水貂肠炎病毒抗原表位(VP2)
CPMV
24
疟疾
烟草
疟疾的B细胞表位
TMV
15,37
流感
烟草
血凝素
TMV
36
癌症
烟草
致癌基因蛋白
TMV
36
AMT，农杆菌介导转化;TMV烟草花叶病毒; CPMV，豇豆花叶病毒

抗体系统产生抗体。虽然抗体的治疗潜力早已被确认（如短期个人抵抗传染性病原体），但它们的生产难度大，只能用于有限的临床治疗。
1989年，希亚特等人首次发现可在转基因植物中生产功能性抗体。从那时起，大量的努力投入到开发生产抗体的植物。可以定位在种子和块茎中的重组抗体，最终实现可以在这些植物组织中储存，运输，管理抗体，这将有利于在发展中国家实行免疫方案。
许多在转基因植物生产的抗体已在人类和动物的卫生保健中得到应用（表2），也能够证明它们在其他应用中是有用的，如生物修复。重组抗体包括完全免疫球蛋白，免疫球蛋白抗原结合片段，人工合成的单链可变的基因融合（抗体）。单链抗体由人工基因编码，该基因由轻和重链可变序列联合得到。植物抗体可能是最理想的免疫方法。粘膜处被动免疫可有效对抗细菌，真菌和病毒。植物抗体针对变形链球菌细胞表面抗原已经证明，可以减少动物和人类的蛀牙。收到关注的被动免疫疗法需要大剂量的抗体，转基因植株可有效用于大规模生产。
此外，已经表明转基因植物可以有效的生产一些以前认为难以在植物中得到的复杂的分泌抗体。这是通过通过单基因（基因叠加）转化植株杂交构建烟草植物表达四种基因来实现的。由此生产的分泌免疫球蛋白A（sIgA）的转基因效率翻两番，免疫球蛋白主要是在黏膜处抵抗微生物感染。分泌型免疫球蛋白A既可更加有效地结合抗原，比最初生产的植物抗体更稳定，更加耐水解。由于这种稳定性的增加，治疗所有的粘膜都是可能的，包括胃肠道。在此可食用植物的使用显然是一个有吸引力的可能性。植物表达系统在产生免疫蛋白的能力上优于细菌表达系统。

表2:转基因植物生产的抗体
目的
植物
蛋白质
表达系统
参考
免疫球蛋白

合成分泌性免疫球蛋白对龋齿的治疗
烟草
具针对变形链球菌抗原2的唾液免疫球蛋白A- G
AMT
940
合成完整的免疫球蛋白
烟草
针对变形链球菌表面蛋白（SAⅠ/Ⅱ）的抗体(Guy’s 13)
AMT
17,40
合成和分泌免疫球蛋白
烟草
针对肌酸激酶的抗体
AMT
11
比较研究植物和动物化源性的免疫球蛋白糖基化
烟草
针对变形链球菌表面蛋白（SAⅠ/Ⅱ）的抗体(Guy’s 13)
AMT
10
单链抗体片段

积累和贮存在块茎的蛋白质
土豆
光敏色素结合抗体
AMT
11,21
治疗非霍奇金淋巴瘤
烟草
小鼠B淋巴细胞瘤的免疫球蛋白的单链抗体
AMT
19
肿瘤相关标记抗原产品
谷物
scFvT84.66 针对 carcinoembryogenic 抗原
粒子轰击
33
AMT，农杆菌介导法

生物制药
转基因植物已建成来表达蛋白，如脑啡肽，α-干扰素，人血清白蛋白，以及两个最昂贵的药物蛋白：葡糖脑苷脂酶和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（见表3）。应用植物学已修改水稻基因来生产能治疗囊肿性纤维化，肝脏疾病和出血的人类α- 1 -抗胰蛋白酶。α-1 -抗胰蛋白酶的转基因水稻试验开始于1998年，从麦芽谷类中提取蛋白。API希望在2004年监管机构能批准转基因植物医药产品的生产。
高雪氏病是一种隐性遗传性溶酶体蓄积疾病，是溶酶体水解酶葡糖脑苷脂酶缺乏造成的。一种由人胎盘组织纯化的酶开发的药物能非常有效的减少临床症状。然而，每年必须用10-12吨的胎盘来生产葡糖脑苷脂酶来提供给普通型高雪氏患者，使它成为世界上最昂贵的药物之一。虽然最近用哺乳动物细胞培养系统来进行生产减少成本，但并没有脱离“最昂贵“药物的行列。1999年由Cramer和美国弗吉尼亚理工大学的同事（弗吉尼亚州）和CropTech（布莱克斯堡，弗吉尼亚州）申请了转基因烟草生产葡糖脑苷脂酶的专利。他们的研究强力的说明了在未来用转基因植物生产葡糖苷脂肪酶以及其他溶酶体酶来用作酶替代疗法的商业可行性。
另一种适宜在转基因植物中表达的蛋白是水蛭素，一种用于治疗血栓形成的抗凝血剂。它最初是生产于医用水蛭，但现在大多数以基因重组的细菌和酵母来进行生产。迄今为止，油菜，烟草，埃塞俄比亚芥菜已能基因重组来生产水蛭素，但事实证明，从种子中提纯是很昂贵的。水蛭素基因与油体膜蛋白基因融合的发展有可能使纯化更容易，更便宜。融合结构是在两个基因之间包含内切蛋白酶识别位点，从而实现重组融合蛋白和水蛭素的分离。通过离心悬浮能很容易的分离出油体膜蛋白-水蛭素融合蛋白和油体。这种纯化的方法，确保水蛭素从植物里分离后仍保持活性，从而限制了环境对其的影响。转基因油籽水蛭素已在加拿大由SemBioSys（卡尔加里，加拿大）商业化种植。

表3:转基因植物生产生物药品
可能的应用或适应症
植物
蛋白质
表达系统
参考
抗凝剂

蛋白C途径
烟草
人类蛋白C（血清蛋白酶）
AMT
13
间接凝血酶抑制剂
烟草,，油菜，埃塞俄比亚芥
人工水蛭素变种2
AMT
6,20
重组激素/蛋白

嗜中性白血球减少症
烟草
人体粒细胞巨噬细胞集落刺激因子
AMT
2,25
贫血
烟草
人工红细胞生成素
AMT
2,25
Antihyperanalgesic by opiate activity
塔勒水芹，油籽
人类脑啡肽
AMT
25,26
创面修复细胞增殖/控制
烟草
人工表皮生长因子
AMT
2,25
丙型和乙型肝炎治疗
水稻,萝卜
人工干扰素α
AMT
2,25
肝硬化
土豆,烟草
人工血清白蛋白
AMT
2,12,25
血液替代品
烟草
人工血红蛋白
AMT
50
胶原
烟草
人工同源三聚体胶原1
AMT
50
蛋白质/肽酶抑制剂

囊性纤维化，肝脏疾病，出血
水稻
人α- 1 -抗胰蛋白酶
颗粒轰击
------

胰蛋白酶抑制剂移植手术
玉米
人工抑肽酶
颗粒轰击
34
高血压
烟草/番茄
血管紧张素- I型转换酶
AMT
21
艾滋病毒疗法
烟草
烟草花叶病毒- U1亚基外壳
蛋白的α-天花粉
AMT
18
高雪氏病重组酶
烟草
葡糖脑苷脂酶
AMT
13,41
保健食品

维生素A缺乏症
水稻
水仙八氢番茄红素合成酶
颗粒轰炸
32
氨基酸缺乏症
土豆
苋菜
Ama1种子白蛋白
AMT
53
AMT，农杆菌介导法

讨论
用转基因植物生产的生物药品将满足其他系统的执行标准和生物制药的安全。植物常常产生类似于人类的蛋白质，但似乎没有什么理由证明。在某些情况下，纯化程序将需要发展，以确保非食用的植物的药品生产，如烟草，除去伴随着的其他潜在有毒的或抗原植物代谢物。即便如此，烟草仍主要用于基础研究，粮食作物更有可能作为商业化生产。在调查了各种作物的潜在蛋白回收率和生产的经济性后，许多开发转基因植物表达系统的公司选择了玉米。
以植物为基础的生物药品值得关注的是糖基化程度和确切性，它在不同动物发现是不同的。一些植物所特有的糖类基团，尤其是定期自身管理时，可能会出现对免疫系统的抗原性攻击，从而导致过敏或免疫。尽管如此，许多产品已经从植物中得到，我们经常碰到食物中的无不良影响的植物糖蛋白。然而药物蛋白糖基化的研究是伴随转基因研究发展而发展的。糖基化是一个值得考虑问题，有可能让缺乏一些酶的突变体参与糖基化途径从而培养出更合适的转基因植物。另外，药物可能经过分离后化学改性。

生物药剂，通常在低浓度时即可引起反应，且可能有较高的毒性。许多具有可能导致它们长期存在于环境或生物蓄积，也有可能损坏非目标有机体（它们是对环境持久性，可以通过细胞膜的亲脂性分子）的理化性质。各种开发的预防环境“污染”的方法已经被应用于现在处于越来越开放的环境中的制药厂。在某些情况下，例如上门讨论的葡糖脑苷脂酶的生产，药物的转基因表达是诱导后的收获，从而防止环境对药品的影响。在其他情况下，如油体膜蛋白-水蛭素的例子，该产品是唯一一个从植物组织分离纯化出来后还具有活性的。在其它文献中防止环境污染的其他方法已被广泛讨论，但都超出了现在讨论的范围。
一般来说，人们会期望从转基因植物中得到生物药品要比丛有潜在污染人类病原体存在的动物来源的生物药品更加安全。此外，正在采取措施以解决环境和健康所关注的问题，包括开发和利用转基因植物进行商业化生物药剂生产。看来，转基因植物拥有安全生产相对廉价的药用蛋白质和肽类产品的巨大潜能。

感谢
我们感谢DETR的出资和对转基因植物释放的风险评估。

参考文献:略

原文：