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全流量大鼠体外循环模型的建立
【摘要】 目的 建立可存活全流量的大鼠体外循环(cardiopulmonary bypass,CPB)模型。方法 8只雄性Sprague-Dawley 大鼠异氟烷吸入诱导麻醉后，经口气管内插管，接呼吸机行机械通气。进行尾动脉、腹壁尾侧浅动静脉和右侧颈外静脉血管穿刺置管等外科准备。经颈外静脉置入的多孔套管为静脉引流通道，以经尾动脉置入套管为CPB动脉灌注管道，血液经过特制膜氧合器进行氧合建立CPB并进行90 min CPB灌注。实验动物均进行血气和血流动力学等基本生理指标监测，并在CPB前、CPB后60 min以及CPB后1周测定细胞因子(IL-6和IL-10)以了解CPB所致的大鼠全身炎症情况。结果 成功建立了不输血全流量大鼠CPB模型，所有实验动物全部存活至7天以上。受试动物IL-6和IL-10在CPB后显着升高，一周后回降到术前正常水平。结论 本实验成功建立了全流量大鼠CPB模型，CPB后大鼠出现明显的全身炎症反应，这为研究CPB并发症病理生理机制以及相应的应对策略提供可靠经济的动物模型。
【关键词】 体外循环;大鼠;模型
　　Abstract: OBJECTIVE To establish a recovery rat model of full-flow cardiopulmonary bypass (CPB). METHODS Eight male Sprague-Dawley rats were used. All subjects received isoflurane inhalation anesthesia, transoral tracheal intubation and mechanic ventilation. Surgical preparations primarily involved with cannulation of four vessels including tail arteries, superficial caudal epigastric arteries and veins, and right jugular veins. The multiorificed catheter cannulated in jugular vein was used for venous drainage; the 20 guage catheter cannulated in tail artery was used for the arterial inflow from the CPB circuit and blood was oxygenated with a customized mini-oxygenator. Ninety minutes cardiopulmonary bypass was performed on the rats. Blood gas analysis and basic physiological measurements were monitored. Plasma cytokines (IL-6 and IL-10) were measured before CPB, 60 minutes after CPB and 1 week after CPB, in order to observe the CPB-induced systematic inflammation. RESULTS CPB was successfully established and all subjects were recovered from surgery and CPB and survived more than seven observation days. The plasma concentration of IL-6 and IL-10 was significantly increased after CPB but returned to the previous normal level in 7 days postoperatively. CONCLUSION A recovery rat model of full-flow cardiopulmonary bypass was successfully established. Systematic inflammation was expectedly induced by CPB, which therefore, presented a satisfactory non-transfusion, full-flow and recovery CPB model in rats for the research of pathophysiological mechanism and complication of CPB related injury.
　　Key words： Cardiopulmonary Bypass; Rats; Models
　　体外循环(cardiopulmonary bypass，CPB)自从上世纪50年代引入临床，已经广泛应用于心脏外科手术中。目前大多数冠脉旁路移植术(约80%)和所有心内直视手术需要借助CPB进行[1]。尽管CPB材料不断更新，技术不断进步，但是其本身仍然是心脏手术术后并发症的主要原因。神经认知功能障碍是CPB后最为常见的神经系统并发症，在术后一个月时高达30%～65%，在术后5个月时仍高达20%～40%[1]。
　　为了研究CPB相关并发症，一些实验室成功建立了大鼠CPB模型。但是大鼠正常心输出量水平为160～180 ml/(kg·min)，而此前的不输血CPB模型流量均在150 ml/(kg·min)以下[4-7]。本研究拟以大鼠为研究对象，建立不输血全流量的CPB模型，观察CPB所导致的炎症变化以评价建模是否成功。此外，本研究还观察实验大鼠是否能够长期(7天)存活。
　　1 材料与方法
　　外科准备 本动物实验经过杜克大学动物委员会批准，并符合美国卫生研究院关于使用实验室动物的相关规定(No. 86-23, revised 1996)。
　　雄性Sprague-Dawley 大鼠(鼠龄14-16周，体重400～450 g，购于Harlan, Indianapolis, IN, USA)，禁食12～16 h，自由饮水。于术日晨以5%异氟烷吸入诱导麻醉后，经口气管内插管，接呼吸机行机械通气，吸入50%空-氧混合气，调整潮气量和呼吸频率，以确保呼气末二氧化碳(PETCO2)在32～42 mmHg之间。在以下的外科准备期间，持续吸入2%异氟烷维持麻醉。将针型YSI 552体温计 (YSI Temperature, Dayton, OH, USA)置于大鼠头部皮下进行持续体温监测。其余手术操作遵循无菌操作原则，手术区域以1%利多卡因浸润。在显微镜下共进行四支血管的穿刺置管。以聚乙烯导管(PE-10)置入腹壁尾侧浅动脉行持续动脉压监测;以24号静脉留置套管针套管进行腹壁尾侧浅静脉穿刺置管，建立起输液给药静脉途径并予以肝素400 IU/kg;以20号静脉留置套管针进行大鼠腹侧尾动脉穿刺置管，作为CPB动脉灌注管道;通过右侧颈外静脉置入 F多孔套管(改制于 French Desilets-Hoffman儿科引导管，Cook Inc., Bloomington, IN, USA)，其尖端至右心房水平，作为CPB静脉流出通道。多孔导管位置通过超声定位(Sonos 7500, Phillips Medical Systems, Andover, MA, USA)。所有置管用丝线原位固定防止滑脱或进气。在外科准备完成后，测量动脉血气，并抽取血液标本，低温离心后-80℃冰箱保存，用以测量细胞因子白介素(IL)-6和IL-10。
　　CPB管道 CPB管道包括一个特制的容积为8 ml的静脉贮血器，蠕动泵(Masterflex, Cole-Parmer仪器公司, Vernon Hills, IL,US)，流量探测器(2N806 流量探头和T208 流量计; Transonics Systems, Inc, Ithaca, NY,US)，特制膜氧合器(Jostra AG, Hirrlingen, Germany)，预充量4 ml，气体交换面积558 cm2。上述各部分以 mm内径无菌硅胶管连接。整个CPB管道预充9ml6%羟乙基淀粉胶体溶液，CPB流量维持在于大鼠正常心输出量水平：160～180 ml/(kg·min)。CPB动脉灌注温度通过水浴系统维持在37℃。外科准备和CPB管道连接情况见图1(修改自Mackensen GB)。
　　图1 外科准备和CPB管道连接情况模式图
　　实验流程 在CPB开始前，静脉途径予以肝素400 IU/kg、芬太尼25 μg/kg、泮库溴铵 mg/kg，并将吸入异氟烷降低至1%。将呼吸频率减半，整个CPB过程中维持该呼吸频率的机械通气，CPB气体流量根据血气结果调整，CPB持续90 min。所有实验动物在CPB后都顺利脱机，恢复正常机械通气。CPB管道中剩余血液常温下以3000转/min离心2～3 min以浓缩预充所致的血液稀释，将浓缩所得红细胞缓慢回输给实验大鼠。逐步退出所有血管置管，并结扎相应血管及缝合伤口。约90 min后大鼠麻醉后苏醒、恢复自主呼吸并拔除气管插管。密切观察受试动物麻醉复苏活动情况，所有实验大鼠全部存活，于手术第二日将动物送回动物房饲养，观察7天。
　　观察指标
　　血气及基本生理指标 持续监测体温、动脉血压、CPB流量。 分别在CPB前、CPB 15 min、30 min、60 min、90 min以及CPB后30 min和60 min测动脉血气(GEM Premier 3000 血气分析仪, Instrumentation Laboratory, Lexington, MA, US)。 间断监测CPB前和CPB期间静脉血氧饱和度(SvO2)以了解组织氧供及代谢情况。
　　血浆细胞因子IL-6和IL-10 通过测定血浆细胞因子水平来了解CPB可能造成的系统炎症反应状况。使用酶联免疫试剂盒(Pierce Endogen, Inc, Rockford, Ill, US)分别测定CPB前、CPB后60 min以及1周后IL-6和IL-10水平以了解促炎因子和抗炎因子状况。
　　统计处理 资料以均数±标准差(±s)表示，应用SPSS 软件进行处理和统计分析，不同时点间均数比较用单因素方差分析，两两比较用LSD检验(Least-significant Difference，最小显着差值法);为有统计学意义。
　　2 结 果
　　血气及基本生理指标 在本模型，大鼠CPB流量始终维持在170～180 ml/(kg·min)之间，符合文献要求的大鼠正常心输出量。尽管CPB动脉灌注的氧合血通过了37℃水浴系统，CPB开始后，大鼠体温仍降低，在15 min时明显低于CPB前;在90 min CPB结束后，大鼠体温开始明显升高。大鼠平均动脉血压、SvO2、PaCO2和SaO2在各个时间之间均无明显差异。CPB后pH值较CPB前明显降低。乳酸在CPB开始后呈现增多趋势，在CPB 15 min和CPB后的观察时点有统计学意义。碱剩余变化与乳酸类似。所有实验动物血糖随着手术时间延长逐渐降低。大鼠血红蛋白在CPB开始后明显降低，但是在所有时点均高于70 g/L。实验动物的基本生理指标和血气分析结果见表1。
　　细胞因子IL-6和IL-10 外科手术和CPB所造成的炎性因子变化见表2。IL-6和IL-10在CPB后显着升高，一周后回降到术前正常水平。
　　3 讨 论
　　为了研究CPB相关并发症，需要建立经济可重复的CPB模型。大动物CPB模型不仅需要复杂的外科技术，而且需要多人同时分别从事外科操作和麻醉及CPB管理。此外，大动物CPB模型动物复苏时还需要复杂的ICU监护、成活率相对较低，这些都导致了大动物CPB模型成本昂贵。对大动物缺乏标准化的神经认知功能的测量手段，也是限制大动物CPB模型使用的一个原因。与大动物相比，大鼠相对廉价而且已经有标准的神经认知功能测量手段使得其广泛的用于各种动物实验。为了确保实验动物的存活率，目前的大鼠CPB模型多为不开胸，而利用血管穿刺置管技术建立CPB所需的血液引流和灌注管道。由于大鼠体积小，而且建立CPB需要尽可能用大内径套管进行多条血管置管(以确保足量的引流、灌注和血压监测和静脉给药途径)，这就需要较高的血管置管技术。因此，目前世界上成功开展大鼠CPB模型的实验室并不多。
　　与本实验室早期和以前文献[5-7]所介绍的CPB模型相比，本全流量可存活大鼠体外循环模型具有以下几个特点：①全流量。此前的不输血CPB模型流量均在150 ml/(kg·min)以下，而本模型则首次实现CPB流量维持在170～180 ml/(kg·min)之间[4-7]，符合文献要求的大鼠正常心输出量。采用多普勒超声准确定位多孔套管在右心房的位置确保了充分的静脉引流，以及采用20号留置针套管作为CPB动脉回流管道确保了动脉回流的低阻力，这些因素确保了在最低限量预充前提下的足表2 炎性细胞因子IL-6和 IL-10(pg/ml，±s)表1 血气及基本生理指标够CPB流量。②不输血。由于采用了特制膜氧合器，预充量仅为4 ml，气体交换面积达558 cm2，最大限度的减少了CPB的预充量。③可存活。本模型在建立动脉测压和静脉输液管道时采用的是腹壁尾侧浅动脉和浅静脉，保留了大鼠的股动脉和股静脉，这虽然增加了外科准备的难度，但是更加有利于大鼠术后的恢复。本研究预实验表明，本模型成功率与大鼠体积有关，实验动物体积越小手术难度越大。我们曾在体重300～325 g大鼠上进行尝试，其成功率在80%～90%之间，在本研究中，大鼠体重400～450 g，所有实验动物全部存活。
　　尽管本模型在最大限度上模拟了临床心脏手术和体外循环，但是仍然存在一些重要不足。正中开胸、直接的心脏操作、主动脉阻断及心脏停跳几乎是目前心脏手术的必然步骤，但在本模型上均没有能够实施。如果对大鼠实施正中开胸和直接心脏操作，受试动物估计难以存活。近期有研究者在大鼠CPB模型上尝试正中开胸、直接阻断主动脉并灌注停跳液，大鼠心脏成功被停跳，但是该研究者并没有观察受试大鼠是否也能够成功存活。事实上该受试大鼠理论上讲没有存活可能，其原因不光由于正中开胸，而且是为了测量大鼠心脏功能和灌注停跳液，这些受试大鼠双侧颈总动脉均被置管结扎。如何能在这类普通体外循环模型基础之上实施停跳液心脏停跳是该模型发展的一个方向。
　　从本研究炎性指标结果来看，在外科操作和CPB后，IL-6和IL-10显着升高，一周后回降到术前正常水平。这从生化标记物上进一步证明了建模的成功，实验动物体温在脱机后明显升高也可能与炎性反应有关。由于预充所致的血液稀释，大鼠血红蛋白浓度在转机后显着降低，但是其稀释程度仍与目前的临床实践相符合。从乳酸和碱剩余指标来看，实验大鼠存在某种程度灌注障碍，这可能与血红蛋白浓度降低或/和非搏动性CPB灌注有关。
　　总之，本实验首次成功实现了可存活大鼠体外循环模型的“全流量”，并从炎性指标方面证明了该模型的成功性。这将为研究心脏手术和CPB并发症病理生理机制以及相应的应对策略提供可靠经济的动物模型。
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