xb三、细胞工程的技术基础.ppt

第三章第三章细胞工程的技术细胞工程的技术(jsh)(jsh)基基础础第一页，共四十八页。第一节基本设备第一节基本设备(shbi)第二节基本技术第二节基本技术第二页，共四十八页。2第一节基本第一节基本(jbn)设设备备一设备一设备(shbi)与器与器材材二器材处理二器材处理第三页，共四十八页。3一、设备与器材 大型设备类：无菌室、超净工作台、无菌箱、CO2培养箱、倒置显微镜、实体镜、高速(o s)离心机、超速低温离心机、冰箱、超低温冰箱、液氮装置。第四页，共四十八页。4第五页，共四十八页。5第六页，共四十八页。6培养箱第七页，共四十八页。7第八页，共四十八页。8第九页，共四十八页。9光照(gungzho)培养室第十页，共四十八页。10第十一页，共四十八页。11显微镜室第十二页，共四十八页。12第十三页，共四十八页。13第十四页，共四十八页。14第十五页，共四十八页。15第十六页，共四十八页。16第十七页，共四十八页。17第十八页，共四十八页。18第十九页，共四十八页。19 消毒灭菌设备：蒸汽压力消毒器、电热干燥箱、过滤除菌装置、离子发生器、耐酸(nai sun)耐碱容器、吸管自动冲洗器、超声波清洗器；第二十页，共四十八页。20灭菌(mi jn)室第二十一页，共四十八页。21第二十二页，共四十八页。22第二十三页，共四十八页。23第二十四页，共四十八页。24第二十五页，共四十八页。25 配液用具：水纯化装置、离子交换树脂装置、电子天平、磁力搅拌器、蒸发器等；制备、培养、保存细胞用品：解剖(jipu)器具、80200目尼龙网或不锈钢网、血细胞计数板、培养器皿、细胞培养板（不同孔数）、涡流混悬器、恒温水浴振荡器、细胞冻存管、玻璃安瓿、真空低温干燥器、厚质玻璃容器等。第二十六页，共四十八页。26第二十七页，共四十八页。27第二十八页，共四十八页。28第二十九页，共四十八页。29第三十页，共四十八页。30第三十一页，共四十八页。31第三十二页，共四十八页。32第三十三页，共四十八页。33第三十四页，共四十八页。34第三十五页，共四十八页。35二、器材(qci)处理 玻璃器皿的清洗：浸泡刷洗浸酸冲洗 橡胶用品的处理：冲洗碱煮冲洗浸酸冲洗蒸煮清洗除菌滤器的处理：高压灭菌塑料器皿的清洗：冲洗碱浸冲洗酸浸冲洗漂洗金属器械的清洗：汽油去脂洗净酒精擦蒸煮或高压灭菌包装：包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒(fnh)、玻璃等，避免消毒后再污染；消毒灭菌：干烤、高压蒸汽灭菌、滤过除菌、紫外线、射线、（甲醛）熏蒸消毒、化学消毒剂、抗生素消毒灭菌。第三十六页，共四十八页。36一、无菌技术1.各种灭菌方法(fngf)及其适用范围A湿热灭菌法（高压蒸汽灭菌法、常压蒸汽灭菌法、间歇灭菌法）B 干热灭菌法（火焰灭菌、干热灭菌）C电离辐射灭菌D 紫外线杀菌E过滤除菌F化学杀菌G熏蒸灭菌法第二节基本第二节基本(jbn)技技术术第三十七页，共四十八页。372.无菌操作过程A 清洗(qngx)玻璃器皿的清洗 实验材料的清洗B 灭菌 培养材料的灭菌以药剂灭菌法为主主要考虑：药剂的灭菌效果、材料对药剂的耐受力第三十八页，共四十八页。38第三十九页，共四十八页。39第四十页，共四十八页。40 培养基灭菌高压蒸汽灭菌过滤灭菌C 接种经过表面灭菌的材料，按不同(b tn)的要求，经过剪切、整理后，移植到培养基上培养的过程。接种室（无菌操作室）的灭菌接种台的灭菌工作人员注意事项第四十一页，共四十八页。413.3.实验室生物安全实验室生物安全l概念：指那些用以防止(fngzh)发生病原体或毒素无意中暴露及意外释放的保护原则、技术及实践。l传染性微生物的危险程度分4级1级、2级、3级、4级l生物安全水平（BSL）相应的也分为4级BSL 1（基础实验室）BSL 2（基础实验室）BSL 3（防护实验室）BSL 4（最高防护实验室）第四十二页，共四十八页。42二、细胞制备：机械分散法 淋巴细胞分离：肝素抗凝血剂+Hanks 稀释 分级分离 吸取 加其它培养液单细胞悬 胰蛋白酶 细胞 T、B细胞分离：尼龙棉柱过滤(gul)B细胞粘附 液的制备 酶消化法 分离法 T细胞过滤 胶原酶 CD4/CD8细胞分离：SephadaG-10柱或 流式细胞分选仪 螯合剂分散法 单核/巨噬细胞分离淋巴细胞不粘，（与玻面粘附）单核/巨噬细胞粘附第四十三页，共四十八页。43三、细胞计数法：血细胞计数板或器 细胞分装；四、细胞培养与传代五、细胞形态学检查法：一般形态观察利用倒置(dozh)显 普通染色观察（Giemsa染核）微镜观察法 特殊染色法：DNA（Feulgen反应）、DNA-RNA（甲基-派洛宁）、糖（PAS）、脂（苏丹红II）、线粒体（詹纳斯绿B液）、叶绿体（吖啶橙）第四十四页，共四十八页。44 吖啶橙：DNA、RNA利用荧光显微镜观察法 扫描 免疫荧光染色 透射(tu sh)利用电子显微镜观察法：扫描或透射。六、无血清培养液的设计和合成七、细胞的冻存、复苏与运输八、细胞培养的放大试验（生产）九、细胞培养时污染的检测、排除第四十五页，共四十八页。45本章本章(bn zhn)(bn zhn)内容到此结束内容到此结束谢谢谢谢(xi xie)(xi xie)大家大家欢迎欢迎(hunyng)(hunyng)研讨研讨第四十六页，共四十八页。46【复习思考题】【复习思考题】1常用的灭菌方法有哪几类？概述它们的原理。2判断题：1.已经洗净的仪器可以用布或纸擦干。2.无菌操作一般要求在酒精灯火焰前10-20cm范围内进行。3.过滤除菌的适用(shyng)对象是易被高温破坏的材料如抗生素、糖、激素等试剂。第四十七页，共四十八页。47内容(nirng)总结第三章。玻璃器皿的清洗：浸泡刷洗浸酸冲洗。橡胶用品的处理：冲洗碱煮冲洗浸酸冲洗蒸煮。塑料器皿的清洗：冲洗碱浸冲洗酸浸冲洗漂洗。金属器械的清洗：汽油去脂洗净酒精擦蒸煮或高压灭菌。主要(zhyo)考虑：药剂的灭菌效果、材料对药剂的耐受力。经过表面灭菌的材料，按不同的要求，经过剪切、整理后，移植到培养基上培养的过程。BSL 1（基础实验室）。DNA-RNA（甲基-派洛宁）、。47第四十八页，共四十八页。