学术讨论—Transwell是检测细胞侵袭能力的检测方法..docx
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1、Transwell是检测细胞侵袭能力的检测方法我们所使用的是Chemicon公司的ECM554,基质胶已经包被好了,买来就可以用,很方便,而且我们算过,跟自己买胶来包被价格相差不大。这种胶4度下很软,37度那么变得比拟坚硬,因此用前应先放在培养箱中10分钟作用,使胶完全凝固。该试剂盒对穿过膜的细胞进行荧光染色,再用裂解液裂解细胞后检测荧光值。我们在实际使用的时候对穿过膜的细胞采用1%结晶紫染色,镜下计数细胞数目。结晶紫也可以用33%醋酸溶解,再用酶标仪570nm检测,同样可以反响穿过细胞数因为基质胶的厚度直接影响穿过膜的细胞数,因此建议有条件的话还是买这类已经铺好胶的试剂盒,比拟可靠。说明书该
2、公司网上可以下载,对原理也有比拟详细的阐述,可以去查一下。我们做的时候,上室用0.5%BSA的培养液,下室用5%血清的培养液,下室血清的浓度可根据细胞类型的不同进行调整,如果细胞侵袭能力强,可适当降低血清浓度,否那么可适当提高血清浓度。需要注意的是:1。上室内的细胞数目要适当,过多,穿过膜的细胞会过多过快,如果用计数法的话将难以计数;最少也要保证在收样的时候,上室内还要有细胞存在。具体细胞密度需要自己摸索。2。细胞计数的准确性对结果影响很大,各组间最好不要分开计数。尽量用同一密度的细胞悬液给予不同处理,保证各组细胞量一致3。对细胞的处理不可影响细胞生存。否那么难以肯定是细胞量的改变还是侵袭能力
3、改变侵袭小室其实不止是transwell的,其它像Boyden chamber、Thincert也挺好用的。我用过Thincert,个人感觉不错,而且价格廉价,是grelner的,孔径8微米用于24孔板的一个才45块人民币,而且可以零买,不想transwell,总是一箱一箱的卖,实在是太贵了!侵袭实验要结合实验目的,不一定非要包被的。下面奉上用Thincert做侵袭实验的步骤(摘自?A quantitative cell migration assay using ThinCert cell culture inserts?,大家如需要,可用google搜之:1. Prepare cell c
4、ultures according to standard cell culture procedures2. Starve cells overnight in serum-free medium with 0.2 % BSA3. Harvest cells and wash them twice in PBS4. Resuspend cells in serum-free medium with 0.2 % BSA to an appropriate final cell concentration (e.g. 106/ml5. Place 24 well ThinCertTM cell
5、culture inserts in the wells of a CELLSTAR 24 well cell culture plate6. Add 600 l culture medium with or without chemoattractant to each well of the cell culture plate7. Add 200 l cell suspension to each cell culture insert8. Incubate the cell culture plate for 3-24 h in a cell culture incubator at
6、37C and 5 % CO29. Remove the cell culture medium from each well of the cell culture plate and replace it by 450 l serum-free culture medium with 8 M Calcein-AM10. Incubate for 45 min in a cell culture incubator at 37C and 5 % CO211. Remove the culture medium from the cell culture inserts12. Transfer
7、 the cell culture inserts into a freshly prepared 24 well cell culture plate containing 500 l prewarmed Trypsin-EDTA per well13. Incubate for 10 min in a cell culture incubator at 37C and 5 % CO2, agitate the plate from time to time14. Discard the cell culture inserts and transfer 200 l of the Tryps
8、in-EDTA solution (now containing the migratory cells from each well into a black flat bottom 96 well plate15. Read fluorescence in a fluorescence plate reader at an excitation wavelength of 485 nm and an emission wavelength of 520 nm从第9步开始计数侵袭细胞时,这份说明书用的是荧光标记,但这种方法本钱高而且繁琐。我做的时候改为giemsa染色,发现效果不错,具体如下
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