结直肠癌的分子基础-中文.doc

结直肠癌的分子基础
Molecular Basis of Colorectal Cancer
作者：Sanford D. Markowitz, M.D., Ph.D., and Monica M. Bertagnolli, M.D.
单位：From the Department of Medicine and Ireland Cancer Center, Case Western Reserve University School of Medicine and Case Medical Center, Cleveland (S.D.M.); the Howard Hughes Medical Institute,Chevy Chase, MD (S.D.M.); and Brigham and Women’s Hospital, Boston (M.M.B.).

在美国，每年有160，000例结直肠癌被确诊，并且有57，000例患者因此死亡，这使得结直肠癌成为导致成年人死亡的第二大主要原因。结直肠癌形成初是良性的腺瘤息肉，接着息肉发展成高级的发育异常的腺瘤，然后进一步发展为具有侵袭性的癌症。由于这种Invasive cancer的生长受到结肠壁的限制，因此它是可以被治愈的，这样的癌症被称为tumor–node–metastasis stages I and II。但是如果不及时治疗，它们会蔓延到附近的淋巴结（stage III），最终转移到远处的位置（stage IV）。一期和二期的肿瘤可以通过手术切除治愈，有超过73%的三期肿瘤病例可以通过手术和辅助性的化疗两种方法的结合而治愈。尽管最近在化疗方面取得的进展可以提高病人存活率，但是四期病例一般情况下是不可治愈的。

结直肠癌的临床特征是很多因子在不同水平上相互作用引起的。（图1—图表内容见最后）我们研究面临的挑战就是：了解不同个体对CRC的易感性的分子基础，找出起始肿瘤发生，促进其发展的因子，并了解它们如何对抗抗肿瘤药物。该综述概述了这个领域最新的进展。

基因组不稳定性（genomic instability）
基因组稳定性的丢失可以导致结直肠癌的形成，因为它促使一些肿瘤相关基因的突变。在结直肠癌中，基因组不稳定有几种形式，每种形式都由不同原因导致。

1. 染色体不稳定性（chromosomal instability）
在CRC中，最常见的基因组不稳定性形式是染色体不稳定。它会导致染色体拷贝数目及其结构发生很大变化。染色体不稳定性也是引起一些肿瘤抑制基因（例如APC，p53，SMAD family member 4）的野生型拷贝物理缺失的有效机制，而这些基因的正常激活可以抑制一些恶性表型。在CRC中存在这样一些基因的抑制性突变，它们的正常功能是在复制过程中保持染色体的稳定性。这些基因突变的累积性效应导致了在这类肿瘤中大部分的染色体不稳定。与其他的一些癌症相比，CRC一般不涉及基因拷贝数的增加或者基因重排。
2. DNA修复缺陷（DNA-repair defect）
在一些CRC患者中，存在一些DNA碱基错配修复基因（mismatch-repair genes）的失活。（图2，3）这些失活可以是遗传的，例如遗传性非息肉结肠癌（Hereditary non-polyposis colon cancer，HNPCC），也可以是获得性的，例如在一些肿瘤中，存在一些编码DNA错配修复蛋白基因的甲基化相关沉默。

在HNPCC患者中，碱基错配修复基因（主要是MLH1和MSH2）的生殖系（germ-line）缺陷导致病人在平均年龄45岁时，罹患结直肠癌的风险达到大约80%。HNPCC病人错配修复功能的丧失不仅仅是由于生殖系错配修复基因的突变所导致，它也可以由于野生型的双亲等位基因在体细胞中的失活（somatic inactivation）引起。错配修复缺陷引起的基因组不稳定性大大的加快了HNPCC病人向结直肠癌的发展。因此，我们推荐HNPCC 突变携带者每年都做结肠镜检查，有较高程度结肠损伤的病人也应该考虑预防性结肠切除手术。另外一些错配修复基因（MSH6）的生殖系突变减缓了家族性CRC脆弱性。错配修复基因的体细胞失活在非家族性结直肠癌病人中出现的可能性大约是15%。在这些病人中，由于MLH1基因启动子区甲基化导致的双等位基因沉默阻止了错配修复（图2，3）。

错配修复功能的丧失很容易通过微卫星不稳定性的相关附带像（epiphenomenon）识别。附带像：在DNA重复序列中不能修复链滑动（strand slippage），从而改变在基因组中分散存在的单核苷酸或二核苷酸重复序列的大小。错配修复缺陷也可以通过免疫组化分析检测到，该方法可以识别到一个错配修复蛋白的缺失。通过错配修复缺陷而定性的癌症主要发生在近端结肠和一些散发病例中，主要跟older age和female sex有关。在错配修复缺陷的病人中，一些肿瘤抑制基因是失活的，如transforming growth factor βreceptor typeⅡ（TGFBR2）和BCL2-associated X protein（BAX），它们的功能域包含有单碱基或二碱基的重复序列。

导致结直肠癌的另一个途径涉及到一个碱基切除修复基因—MUTYH,也叫做MYH---的生殖系失活。MYH 蛋白可以切除DNA上的8-氧鸟嘌呤，后者是鸟嘌呤氧化损伤的产物。如果一个人携带有两个生殖系MYH等位基因的失活，那么他会有息肉表型，在60岁时罹患结直肠癌的风险几乎是100%的。MYH相关息肉病的诊断需要基因检测，MYH 突变中，Y165C和G382D两个位点的突变率达到了85%。到目前为止，MYH基因的体细胞失活在结直肠癌中还没有被检测到。
3. 异常DNA甲基化（aberrant DNA methylation）
基因的表观沉默大多数是通过DNA异常甲基化介导的。这也是CRC病人基因失活的一个机制。胞嘧啶的甲基化形式是：在甲基化转移酶（DNMT）的催化下，DNA中CpG island中的胞嘧啶被选择性的添加甲基，形成5′甲基胞嘧啶。在正常基因组上，胞嘧啶的甲基化发生在外显子之外的DNA重复序列区域；另外在近半基因的启动子区域一般也是没有CpG岛的甲基化现象。相比较而言，在结直肠癌基因组中，尽管也存在一个总体水平上的胞嘧啶甲基化的减少，但是在某些CpG岛相关的启动子中有很多异常甲基化现象。启动子区域的异常甲基化会导致该基因的表观沉默。在一些由于微卫星不稳定导致的结直肠癌散发病例中，体细胞的表观沉默（somatic epigenetic silencing）阻遏了MLH1基因的表达。

在CRC中，有这样一些区域，它们作为群（group）被异常甲基化，这个现象叫做CpG岛甲基子表型（CpG island methylator phenotype，CIMP,or CIMP-high）。尽管我们还不知道CIMP的分子机制，但是这个现象在15%的结直肠癌病人中出现，在100%的MLH1异常甲基化的肿瘤中出现。MLH1沉默能导致的病症已经被确认，但是在结直肠癌中其他的一些表观沉默事件所发挥的作用仍然有待研究。在CIMP中，一个异常甲基化的中间水平被定义为亚型（subtype）（例如CIMP2,CIPM-low），它可以引起30%的CIMP病例。异常甲基化的第三种类型可以用编码波形蛋白（vimentin）基因的外显子1（exon1）来举例说明。尽管这个位点在正常的结肠粘膜或者结直肠癌中是不表达的，但是它在53~83%的结直肠癌病人中视被异常甲基化沉默的。（图3）

肿瘤抑制基因的突变失活
1. APC
Wnt信号通路的激活被认为是结直肠癌的起始事件。当致癌蛋白β-链蛋白（catenin）结合到核伴侣（T细胞因子-淋巴细胞增强子家族的成员）时，会导致下游调节细胞活化的转录因子被激活，wnt信号通路发生。（图2，表2）β-链蛋白的降解复合物通过蛋白质水解调控β-链蛋白的水平。APC便是这个降解复合物中的组分，它不仅能够降解β-链蛋白，也能够抑制它的核定位（nuclear localization）。

在结直肠癌中最常见的突变就是APC的失活突变。当APC不发挥作用时，β-链蛋白在核内积累，使wnt通路持续激活。生殖细胞中APC的突变会引起家族性的腺瘤息肉病。APC基因突变的携带者在40岁时患结直肠癌的风险达到100%。在很多结直肠癌散发病例中存在APC的体细胞突变和缺失。在一小群野生型APC肿瘤病例中，β-链蛋白的突变使APC蛋白不能降解β-链蛋白，最终也导致wnt信号通路的激活。
2. TP53
由于TP53突变引起的p53通路的失活是导致结直肠癌的第二大关键步骤。在很多肿瘤中，TP53的两个等位基因都是失活的，这通常是通过错义突变—该突变会导致p53转录失活，和17号染色体短臂上第二个TP53等位基因的缺失来实现的。野生型p53介导了细胞周期（cell cycle arrest）和cell death checkpoint，它可以被很多细胞压力激活。TP53的失活经常与大腺瘤向侵袭性癌症的转化有关。在很多由于错配修复缺陷引起的结直肠癌中，TP53是野生型的，然而p53通路的活性是降低的，这可能跟BAX突变导致的程序性死亡有关。
3. TGF-β 肿瘤抑制通路
TGF-β信号的突变失活是结直肠癌发展过程中的第三步。大约有三分之一的结直肠癌患者存在由于体细胞突变导致的TGFBR2的失活。在有错配修复缺陷的肿瘤中，TGFBR2的失活是该基因编码序列上多腺嘌呤重复的移码突变引起的。在至少一半的没有错配修复缺陷的结直肠癌中， TGF-β信号通路是被阻断的。这可以通过抑制影响TGFBR2激酶域的错义突变实现。但更普遍的是通过突变或者缺失使得TGF-β信号通路的下游组分SMAD4或者其转录因子伴侣SMAD2或SMAD3失活来使该信号通路被阻断。TGF-β信号通路的失活与腺瘤向高级发育异常或者癌症的发展相关。

激活原癌通路（activation of oncogene pathways）
1. RAS and BRAF
一些原癌基因在促进结直肠癌形成过程中发挥着重要作用。RAS 和 BRAF的突变会激活MAPK（mitogen-activated protein kinase）信号通路，这种情况在结直肠癌中分别以37%和13%的比例存在。RAS的突变，主要是在KRAS中，激活了GTPase，GTPase直接作用于RAF。BRAF的突变激活了BRAF丝氨酸-苏氨酸激酶，最终引起MAPK信号级联。BRAF的突变在小的息肉中也可以检测到。与RAS突变相比，它们在增生息肉，锯齿状腺瘤以及近端结肠癌中的突变是普遍存在的。
2. PI3K-磷脂酰肌醇激酶（phosphatidylinositol 3-kinase）
三分之一的结直肠癌病人的PI3KCA处于体细胞激活状态。PI3KCA基因编码PI3K的催化亚基。以下基因的变化和PI3K的突变效果相似：PTEN的丢失，它是PI3K信号的抑制子；IRS2（胰岛素受体底物2）的扩增，它是PI3K信号通路的上游激活子；或者AKT和PAK4的扩增，它们是PI3K信号的下游中介子。

结直肠癌基因组测序
DNA测序技术取得的进展使得对人癌症的全编码基因组的测序成为可能。高通量测序NCBI参考序列数据库中的18，000个成员，发现癌症相关的体细胞突变基因848个。其中有140个基因被鉴定为癌症基因，并对癌症表型形成有作用。

Ⅳ期的结直肠癌基因组中有15个突变的癌症基因和61个passenger gene---指低频率的突变基因。低频率突变的优势表明在结直肠癌中大量的遗传异质性（指表现型一致的个体或同种疾病临床表现相同，但可能具有不同的基因型）。高程度的遗传异质性使确定一个单一突变事件的临床表现变得困难。

结直肠癌基因组的高通量测序鉴定出了很多新的突变基因。它们包括ephrin 受体EPHA3和EPHB6（酪氨酸蛋白激酶受体家族），这两个基因在20%的结直肠癌中都有突变。还有FBXW7，在调节cyclin E水平的蛋白质降解通路中起作用。在20%的结直肠癌中发现有FBXW7基因的突变。在高通量的测序中，我们面临的挑战是如何通过鉴定出一些可以作为突变事件的下游靶标的生物通路和过程，从而降低研究140个癌症基因的复杂性。

染色体组变化和肿瘤演进（genomic changes and tumor progression）
通过对同一个患者的原发性结直肠癌（primary colorectal cancer）和远处转移（distant metastases）进行全基因组测序，结果表明在远处转移中没有发现新的突变存在。这说明对癌症转移来说不需要形成新的突变。也说明在原发性肿瘤中，当最终的突变（final mutation）出现时，癌症会迅速转移，需要的时间不足两年。

生长因子通路（growth factor pathway）
1. 前列腺素信号的异常调节（aberrant regulation of prostaglandin signaling）
在结直肠癌中，一些生长因子通路的激活是普遍存在的。腺瘤发育中的早期关键步骤是激活前列腺素信号。炎症或者丝裂原相关的COX-2的激活，都可以导致前列腺素E2的合成，该因子与结直肠癌的形成有密切关系。另外，15-PGDH（15-prostaglandin dehydrogenase），一种催化前列腺素降解的速率限制酶，它的缺失可以增强前列腺素E2的活性。接近2/3的结直肠癌中有COX-2的上调表达，80%的结直肠腺瘤和癌症都存在15-PGDH的缺失。临床试验表明，用非甾体类抗炎症药物（nonsteroidal antiinflammatory drugs）抑制COX-2的表达后，新的腺瘤发育被阻止，已经形成的腺瘤也有消退。
2. 表皮细胞生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）
EGF是一种对小肠细胞有营养作用的可溶性蛋白。临床研究表明EGFR在结直肠癌亚群中有重要作用。EGFR通过激活MAPK和PI3K信号级联介导了信号传导。最近的临床试验表明：一些高级的结直肠癌，指具有上述通路中的促肿瘤突变----包括KRAS，BRAF，和PI3K的p110亚基的激活突变，抗EGFR药物对这些大肠癌不起作用。
3. 血管内皮细胞生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）
组织损伤或正常组织的生长都会诱导VEGF的产生，但研究表明VEGF的表达会促使血管形成（angiogenesis）。临床研究表明，血管形成通路在结直肠癌的发展中甚至有致死的可能性。用抗VEGF的抗体阿瓦斯汀（bevacizumab）处理后，高级结直肠癌患者的寿命平均延长了4.7个月。
4. 干细胞途径（stem cell pathway）
可以自我更新的结直肠癌干细胞，会存在于一些合适的地方，例如肝，并会导致癌症转移。目前，尽管一些细胞表面蛋白（像CD133，CD44，CD166和乙醛脱氢酶1）都是promising 标志，但是我们仍旧不可能分离出个体的结直肠癌干细胞。正常的干细胞存在于结肠腺窝中，它依赖于粘性和可溶的基质-表皮相互作用来维持分裂和分化。结直肠癌干细胞的调节机制是很有前途的研究领域，因为能够控制结直肠癌干细胞生长的agents理论上可以用作癌症治疗。

预测和预后的标志（predictive and prognostic markers）
我们仍旧面临的挑战还有如何将我们对结直肠癌在基因组水平上的认识应用到临床上的预测和预后。（表3）目前，根据EGFR信号组分RAS和BRAF的突变，抗EGFR的药物已经被应用在结直肠癌治疗中。对预后有用的基因标识很少。例如，一些抑癌基因，例如APC，MLH1和MLH2，的生殖细胞突变，表明患结直肠癌的高风险，推荐这样的病人能够采取切除手术。其他的一些体细胞突变标志还没有被确认有预后价值。错配修复缺陷突变的预后价值在散发性结直肠癌中较好。Ⅱ期和Ⅲ期大肠癌的低存活率与p27---细胞周期的前凋亡调控子---的缺失有关，或者与18号染色体长臂上的异质性丢失有关。

非侵袭性分子检测（noninvasive molecular detection）
对结直肠癌早期检测的分子诊断学的发展在结直肠癌遗传学向临床实践过渡的过程中起重要作用。例如对一些只在结直肠癌中特异的突变进行检测，对结直肠癌患者的排泄物DNA中的癌症相关DNA异常甲基化的检测。这些化验对检测早期的大肠癌有46~70%的敏感性，优于便血检测。结直肠癌的排泄物DNA检测（stool DNA testing）已经被列为美国癌症社会（American cancer Society）中对癌症检测的指导方针。血浆中细胞游离（cell-free）DNA的化验在临床上对发育期的癌症检测可能是有用的，对肿瘤特异的血浆蛋白或者RNA表达谱仍然有待研究。

人群易感性的遗传学影响（genetic influences in population susceptibility）
遗传流行病学和双胞胎研究表明，35~100%的结直肠癌和腺瘤在有遗传易感性的人群中发生。另外，有一些家族患有HNPCC相似病（HNPCC-like syndrome），但是没有任何迹象表明该家族中有错配修复缺陷。用连锁的方法已经找到了一些包含高渗透易感基因的基因位置（genomic loci），但是很多还未发现。一些基因组水平上的研究也鉴定出了一些跟易感性相关的生殖细胞DNA变异子，但是临床应用很可能受限制，因为跟这些变异子相关的风险较低？。

结论
分子水平上对结直肠癌的研究可以提供对高风险家族性疾病的遗传检测，也找出了一些预测标志可以让病人在药物治疗中对症下药，另外分子诊断学也在早期癌症的非侵袭性检测中发挥重要作用。此外，一些可以作为新的药物靶标的生物通路也被鉴定出来。高频突变基因对药物开发而言是吸引人的，但是这些突变下游的一些普遍的信号通路也可以作为药物治疗的靶标，而且后者相对更容易驾驭。对早期结直肠癌的分子分析最近取得的进展表明，对控制疾病最早形成步骤中的基因和通路和对个体易感性的研究，在临床管理中起作用。

对引起癌症转移表型的信号的研究可以在药物研发中提供必要的信息，这些药物可以控制或抑制更近一步的肿瘤。大量的新的研究使我们相信，我们对大肠癌分子基础的认识，将会继续减轻这个疾病所造成的负担。
（end）

图1，多因子结直肠癌形成。

图1，多因子结直肠癌形成。导致结直肠癌起始，促进，和发展的分子事件有很大程度的相关性。这个动态过程涉及到了环境因素，导致个体对癌症易感性不同的生殖系因子（germ-line factor），和结直肠上皮细胞的一些体细胞突变的累积。

表1，结直肠癌中基因组不稳定型。（表格翻译略）

图2，促使结直肠癌发展的基因和生长因子通路。

图2，促使结直肠癌发展的基因和生长因子通路。
在结直肠癌发展中，变异的基因在图表的最上一行显示。微卫星不稳定（MSI）通路是由错配修复基因（MMR）突变或MLH1的异常甲基化所引起的。它也和一些下游基因，如TGFBR2和BAX基因的突变有关。MLH1的异常甲基化和BRAF的突变和锯齿状腺瘤形成通路相关。“？”，问题标记表明对癌症转移特异的遗传学或表观遗传学的变化还没有被发现。图表的最下面一行显示了结肠瘤形成（colon neoplasia）中关键的生长因子通路。CIN表示染色体不稳定性，EGFR—表皮细胞生长因子受体，15-PGDH—15前列腺素脱氢酶，和TGF-β—转化生长因子β。

图3，促使结肠瘤形成的基因不稳定通路。

图3，促使结肠瘤形成的基因不稳定通路。
该图表明了在结直肠癌基因组不稳定性中一些重要通路的相互重叠关系：染色体不稳定性，由DNA错配修复缺陷（生殖细胞缺陷—Hereditary nonpolyposis colon cancer；体细胞获得性缺陷—MLH1methylation）引起的微卫星不稳定性，和CpG island甲基化子表型。

表2，与结直肠癌相关的抑癌基因和原癌基因。（表格翻译略）

内容总结

（1）通过错配修复缺陷而定性的癌症主要发生在近端结肠和一些散发病例中，主要跟older age和female sex有关
（2）它也和一些下游基因，如TGFBR2和BAX基因的突变有关