JJF 1828-2020ATP荧光检测仪校准规范-(高清版).pdf
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1、中华人民共和国国家计量技术规范J J F1 8 2 82 0 2 0A T P荧光检测仪校准规范C a l i b r a t i o nS p e c i f i c a t i o nf o rA d e n o s i n eT r i p h o s p h a t e(A T P)F l u o r e s c e n c eD e t e c t o r s 2 0 2 0-0 1-1 7发布2 0 2 0-0 4-1 7实施国 家 市 场 监 督 管 理 总 局 发 布A T P荧光检测仪校准规范C a l i b r a t i o nS p e c i f i c a t i
2、 o nf o rA d e n o s i n eT r i p h o s p h a t e(A T P)F l u o r e s c e n c eD e t e c t o r sJ J F1 8 2 82 0 2 0 归 口 单 位:全国生物计量技术委员会 主要起草单位:中国计量科学研究院 参加起草单位:河北省计量科学研究院 本规范委托全国生物计量技术委员会负责解释J J F1 8 2 82 0 2 0本规范主要起草人:傅博强(中国计量科学研究院)唐治玉(中国计量科学研究院)参加起草人:宋增良(河北省计量科学研究院)吕 亮(中国计量科学研究院)J J F1 8 2 82 0 2
3、0目 录引言()1 范围(1)2 引用文件(1)3 术语和计量单位(1)3.1 相对光单位(1)4 概述(1)5 计量特性(1)5.1 背景噪声值(1)5.2 检测限(1)5.3 线性范围及相关系数(1)5.4 重复性(1)5.5 相对示值误差(2)6 校准条件(2)6.1 环境条件(2)6.2 标准物质、检测拭子或试剂、仪器(2)7 校准项目和校准方法(2)7.1 背景噪声值(2)7.2 检测限(3)7.3 线性范围及相关系数(3)7.4 重复性(4)7.5 线性误差(5)8 校准结果表达(6)9 复校时间间隔(6)附录A 系列A T P标准工作溶液的配制(7)附录B A T P物质的量测量
4、的线性误差校准不确定度评定示例(8)附录C 光亮度测量的线性误差校准不确定度评定示例(1 3)附录D A T P法校准原始记录格式(推荐性表格)(1 6)附录E 可调弱光发生器模拟法校准原始记录格式(推荐性表格)(1 8)附录F 校准证书(内页)格式(推荐性表格)(2 0)J J F1 8 2 82 0 2 0引 言本规范依据J J F1 0 7 12 0 1 0 国家计量校准规范编写规则的要求编写。本规范主要参考A S TM D 7 4 6 3-1 4 a 燃料、燃料/水混合物、燃料相关的水中微生物三磷酸腺苷(A T P)含量标准检测方法S t a n d a r dT e s tM e t
5、 h o df o rA d e n o s i n eT r i p h o s p h a t e(A T P)C o n t e n to fM i c r o o r g a n i s m si nF u e l,F u e l/W a t e r M i x t u r e s,a n dF u e lA s s o c i a t e dW a t e r制定。本规范为首次发布。J J F1 8 2 82 0 2 0A T P荧光检测仪校准规范1 范围本规范适用于手持式和台式A T P荧光检测仪的校准。2 引用文件本规范引用了下列文件:A S TM D 7 4 6 3-1 4 a
6、 燃料、燃料/水混合物、燃料相关的水中微生物三磷酸腺苷(A T P)含量标准检测方法 S t a n d a r dT e s tM e t h o df o rA d e n o s i n eT r i p h o s p h a t e(A T P)C o n t e n to fM i c r o o r g a n i s m s i nF u e l,F u e l/W a t e rM i x t u r e s,a n dF u e lA s s o c i a t e dW a t e r凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本规范;凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包
7、括所有的修订单)适用于本规范。3 术语和计量单位3.1 相对光单位 r e l a t i v e l i g h tu n i t;R L U A S TM D 7 4 6 3-1 4 a,3.1.1 9三磷酸 腺 苷(A d e n o s i n eT r i p h o s p h a t e,AT P)水 解 为 一 磷 酸 腺 苷(A d e n o s i n eM o n o p h o s p h a t e,AMP)和焦磷酸盐释放化学能驱动荧光素在荧光素酶催化下氧化释放的光量子数的测量单位。注:非S I单位,但与AT P浓度成比例关系。不同的检测仪对于同样的光量子数可能会产
8、生不同的R L U读数。4 概述AT P荧光检测仪(以下简称仪器)由检测仓、控制面板、光电探测器(雪崩二极管或光电倍增管检测器等)和数据采集信号处理系统等组成,并配备有配套的含有荧光素和荧光素酶混合物的拭子或试剂。采集样本中的A T P后,与荧光素和荧光素酶混合物反应,会产生5 5 0n m左右的生物发光。在适当低的AT P浓度范围内,发光强度与A T P浓度成一定比例关系。根据相对光单位R L U可以推算出样本被食物残渣和微生物污染的程度,对总体洁净度进行监测。仪器可分为手持式和台式。5 计量特性5.1 背景噪声值5.2 检测限5.3 线性范围及相关系数5.4 重复性1J J F1 8 2
9、82 0 2 05.5 相对示值误差6 校准条件6.1 环境条件6.1.1 环境温度:(1 53 0)。6.1.2 相对湿度:8 0%。6.1.3 超净工作台,洁净等级1 0 0级。6.2 标准物质、检测拭子或试剂、仪器6.2.1 A T P纯度有证标准物质:纯度9 9%,相对扩展不确定度U1%(k=2)。6.2.2 A T P检测拭子或试剂:不同仪器配备的专用拭子(手持式)或试剂(台式),依据厂家要求在冰箱中(28)冷藏或-2 0冻藏。在保质期内,临用前从冰箱中取出放置至少1 0m i n,平衡至室温。6.2.3 高压灭菌水或注射用水:无A T P,为医药级无热原水。6.2.4 移液器:(1
10、1 0)L,(1 01 0 0)L,(1 0 010 0 0)L各1支,经检定合格。6.2.5 电子天平:分度值0.0 1m g,经检定合格。6.2.6 离心管:1 5m L,无菌、无AT P。6.2.7 可调弱光发生器:弱光亮度(c d/m2),相对扩展不确定度U5%(k=2),连续可调,并可数字显示光亮度。7 校准项目和校准方法7.1 背景噪声值7.1.1 A T P法在超净工作台中,用(11 0)L移液器移取水(6.2.3)1 0L,滴于拭子的擦拭头(手持式)上或检测池(台式)中,与荧光素和荧光素酶混合试剂混合反应,记录仪器R L U示值,连续读取1 0次,得到仪器背景值。按式(1)计算
11、,背景值的平均值加上其3倍标准偏差s,作为仪器的背景噪声值N。7.1.2 可调弱光发生器模拟法将可调弱光发生器的发光探头放入仪器的检测仓中,关掉光源,记录仪器R L U示值,连续读取1 0次,得到仪器背景值。按式(1)计算,背景值的平均值加上其3倍标准偏差s,作为仪器的背景噪声值N。N=B+3s=B+3ni=1(Bi-B)2n-1(1)式中:N 仪器的背景噪声值,R L U;B 1 0次测定的背景值的算术平均值,R L U;s 1 0次测定的背景值的标准偏差,R L U;2J J F1 8 2 82 0 2 0Bi 第i次测定的背景值,R L U;n 测定次数。7.2 检测限在超净工作台中,用
12、(11 0)L移液器移取某浓度的A T P标准工作溶液(按照附录A配制)1 0L,滴于拭子的擦拭头(手持式)上或检测池(台式)中。浓度选取仪器声称的A T P检出限浓度。某浓度的AT P标准工作溶液与荧光素和荧光素酶混合试剂混合反应,分别记录仪器R L U示值。若此浓度下,仪器R L U示值为0,则浓度增加1 0倍。共进行3个平行测定实验,取平均值。对于背景噪声值(A T P法)为0的仪器,由R L U示值大于0的最低浓度的A T P标准工作溶液对应的A T P物质的量(m o l),按式(2)计算,将R L U示值为1时对应的A T P物质的量作为检测限。nLOD=1ns t d iR L
13、Us t d i(2)式中:nL O D 仪器的检测限对应的A T P物质的量,m o l;1 检测限对应的R L U示值;ns t d i R L U示值大于0的最低浓度的A T P标准工作溶液i对应的A T P物质的量,m o l;R L Us t d i R L U示值大于0的最低浓度的A T P标准工作溶液i的仪器示值平均值,R L U。对于式(1)计算的背景噪声值(AT P法)大于1 0的仪器,由R L U示值平均值大于背景噪声值的最低浓度的AT P标准工作溶液,其R L U示值平均值与背景噪声值的比值为该浓度A T P标准工作溶液的信噪比R,由其对应的A T P物质的量(m o l
14、),按式(3)计算,将信噪比为3时对应的A T P物质的量作为检测限。nLOD=3ns t d iRs t d i=3ns t d iR L Us t d i/N(3)式中:nL O D 仪器的检测限对应的A T P物质的量,m o l;3 检测限对应的信噪比;ns t d i R L U示值平均值大于背景噪声值的最低浓度的A T P标准工作溶液i对应的AT P物质的量,m o l;Rs t d i R L U示值平均值大于背景噪声值的最低浓度的A T P标准工作溶液i对应的信噪比;R L Us t d i R L U示值平均值大于背景噪声值的最低浓度的A T P标准工作溶液i的仪器示值平均值
15、,R L U;N 仪器的背景噪声值,R L U。7.3 线性范围及相关系数7.3.1 A T P法3J J F1 8 2 82 0 2 0在超净工作台中,用(11 0)L移液器分别移取5个浓度的A T P标准工作溶液各1 0L。建议的A T P标准溶液浓度点(至少做5个点,根据最低和最高浓度测出的R L U值的大小,可对标准工作溶液的浓度值做适当的调整):对于手持式仪器,为11 0-1 3m o l/m L、11 0-1 2m o l/m L、11 0-1 1m o l/m L、11 0-1 0m o l/m L和0.51 0-9m o l/m L;对于台式仪器(采用光电倍增管检测器),为11
16、 0-1 5m o l/m L、11 0-1 4m o l/m L、11 0-1 3m o l/m L、11 0-1 2m o l/m L和11 0-1 1m o l/m L。将1 0L的A T P标准工作溶液滴于拭子的擦拭头上,与荧光素和荧光素酶混合试剂混合反应,记录仪器R L U示值。以A T P物质的量(x)和仪器示值R L U(y)绘制校准曲线,进行线性拟合,得到校准方程,按式(4)计算相关系数r,取r0.9 9 5的浓度范围作为线性范围。若r0.9 9 5时,则去掉最高浓度点,增加0.5倍最高浓度值的检测点,与余下的浓度点重新绘制校准曲线;若r0.9 9 5,则新范围作为线性范围。若
17、r仍然0.9 9 5,则继续下调标准溶液的浓度。7.3.2 可调弱光发生器模拟法将可调弱光发生器的发光探头放入仪器的检测仓中,调节发光亮度。对于手持式仪器,设定7个测试点(如使R L U示值分别为1、1 0、1 0 0、10 0 0、25 0 0、50 0 0和75 0 0左右);对于台式仪器(光电倍增管检测器),设定7个测试点(如使R L U示值分别为1 0、1 0 0、10 0 0、50 0 0、1 00 0 0、1 0 00 0 0和10 0 00 0 0左右)。记录下控制器数字显示 的 对 应的 光 亮 度(c d/m2)和 仪 器R L U示 值。以仪 器R L U示 值 和 光 亮
18、 度(c d/m2)进行线性拟合,按式(4)计算相关系数r,取r0.9 9 5的光亮度范围作为线性范围。若r0.9 9 5时,则去掉高值光亮度点12个,取余下的光亮度点,重新绘制标准曲线,直至r0.9 9 5,将新范围作为线性范围。r=ni=1xi-x()yi-y()ni=1xi-x()2ni=1yi-y()2(4)式中:r 线性相关系数;xi 第i个测量点的A T P物质的量或可调弱光发生器的光亮度,m o l或c d/m2;x 用于计算线性范围的测量点的A T P物质的量或可调弱光发生器的光亮度的平均值,m o l或c d/m2;yi 第i个测量点的仪器示值,R L U;y 用于计算线性范
19、围的测量点的仪器示值的平均值,R L U;n 用于计算线性范围的测量点的个数。7.4 重复性7.4.1 A T P法在超净工作台中,用(11 0)L移液器移取某浓度A T P标准工作溶液1 0L(移取的A T P物质的量是检出限的1 0 0倍,如检测限为11 0-1 2m o l的仪器,则浓度选11 0-8m o l/m L),滴于拭子的擦拭头上或检测池中,与荧光素和荧光素酶混合试剂4J J F1 8 2 82 0 2 0混合反应,记录下仪器R L U示值。重复测定1 0次,以1 0次实验结果的相对标准偏差(R S D值)表示仪器测量的重复性。7.4.2 可调弱光发生器模拟法将可调弱光发生器的
20、发光探头放入仪器的检测仓中,调节发光亮度为某数值(c d/m2),使R L U示值为1 0 0左右(手持式)或10 0 0左右(台式)。重复测定1 0次,记录R L U示值。以1 0次实验结果的相对标准偏差(R S D值)表示仪器测量的重复性。按式(5)计算仪器测量的重复性:R S D=1Rni=1(Ri-R)2n-11 0 0%(5)式中:R S D 仪器测量的重复性(相对标准偏差),%;Ri 第i次测量的结果,R L U;R n次测量结果的平均值,R L U;n 测量次数。7.5 线性误差7.5.1 A T P法将7.4.1中1 0次重复性测定的某浓度A T P标准工作溶液的仪器R L U
21、示值的平均值,代入由7.3.1中数据得到的校准方程中,计算得到此AT P标准工作溶液中A T P含量的测定值。以A T P物质的量(x)和仪器示值R L U(y)绘制校准曲线,进行线性拟合,得到校准方程。按式(6)计算A T P物质的量测量的线性误差:i=ci-csicsi1 0 0%(6)式中:i AT P物质的量测量的线性误差,%;ci 按照校准方程计算得到的A T P物质的量的测定值,m o l;csi A T P物质的量的配制值,m o l。AT P物质的量测量的线性误差校准不确定度评定示例见附录B。7.5.2 可调弱光发生器模拟法将7.4.2中1 0次重复性测定的某光亮度下仪器R L
22、 U示值的平均值,代入由7.3.2中数据得到的校准方程中,计算得到此R L U示值对应的光亮度测定值Li。按式(7)计算光亮度测量的线性误差:i=Li-LsiLsi1 0 0%(7)式中:i 光亮度测量的线性误差,%;Li 按照校准方程计算得到的光亮度的测定值,c d/m2;5J J F1 8 2 82 0 2 0Lsi 光亮度的设定值,c d/m2。光亮度测量的线性误差校准不确定度评定示例见附录C。AT P法推荐的校准原始记录格式见附录D。可调弱光发生器模拟法推荐的校准原始记录格式见附录E。8 校准结果表达经校准的A T P荧光检测仪,出具校准证书,校准证书应符合J J F1 0 7 12
23、0 1 0中5.1 2的要求,推荐的校准证书(内页)格式内容见附录F。9 复校时间间隔由于复校时间间隔的长短是由仪器的使用情况、使用者、仪器本身质量等诸因素所决定的,因此,送校单位可根据实际使用情况自主决定复校时间间隔。复校时间间隔建议不超过1年。6J J F1 8 2 82 0 2 0附录A系列A T P标准工作溶液的配制A.1 试剂与材料A.1.1 A T P纯度有证标准物质A.1.2 高压灭菌水或注射用水,配置A T P溶液前,作为空白用手持式仪器测试,R L U示值为0。A.1.3 离心管:1 5m L,无菌、无A T P。A.1.4 离心管:2m L,无菌、无AT P。A.2 仪器A
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