JJF 1665-2017流式细胞仪校准规范-高清晰版-(高清版).pdf
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1、中华人民共和国国家计量技术规范J J F1 6 6 52 0 1 7流式细胞仪校准规范C a l i b r a t i o nS p e c i f i c a t i o nf o rF l o wC y t o m e t e r s 2 0 1 7-1 1-2 0发布2 0 1 8-0 2-2 0实施国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局 发 布流式细胞仪校准规范C a l i b r a t i o nS p e c i f i c a t i o nf o rF l o wC y t o m e t e r sJ J F1 6 6 52 0 1 7 归 口 单 位:全国生物
2、计量技术委员会 主要起草单位:中国计量科学研究院 参加起草单位:贝克曼库尔特商贸中国公司北京深迈瑞医疗电子技术研究院有限公司碧迪医疗器械(上海)有限公司 本规范委托全国生物计量技术委员会负责解释J J F1 6 6 52 0 1 7本规范主要起草人:张 玲(中国计量科学研究院)刘瑛颖(中国计量科学研究院)隋志伟(中国计量科学研究院)参加起草人:潘 娜(贝克曼库尔特商贸中国公司)董丽芳(北京深迈瑞医疗电子技术研究院有限公司)宋志华 碧迪医疗器械(上海)有限公司J J F1 6 6 52 0 1 7目 录引言()1 范围(1)2 引用文件(1)3 术语(1)3.1 等量可溶性荧光分子(1)4 概述
3、(1)5 计量特性(1)5.1 分辨力(1)5.2 线性相关系数(1)5.3 检出限(1)5.4 漂移(1)5.5 重复性(1)5.6 示值误差(1)6 校准条件(2)6.1 环境条件(2)6.2 标准物质和校准设备(2)7 校准项目和校准方法(3)7.1 分辨力(3)7.2 线性相关系数(3)7.3 检出限(4)7.4 漂移(4)7.5 重复性(5)7.6 示值误差(5)8 校准结果表达(5)9 复校时间间隔(6)附录A 校准原始记录参考格式(7)附录B 校准证书内页推荐格式(9)附录C 示值误差校准不确定度评定示例(1 0)J J F1 6 6 52 0 1 7引 言本规范主要参考了J J
4、 G1 0 6 12 0 1 0 液体颗粒计数器和医药行业标准Y Y/T0 5 8 82 0 0 5 流式细胞仪。本规范为首次发布。J J F1 6 6 52 0 1 7流式细胞仪校准规范1 范围本规范适用于基于荧光检测原理的分析型流式细胞仪的校准。其他类型的流式细胞仪(以下简称仪器),可参照本规范执行。2 引用文件本规范引用了下列文件:J J F1 0 7 12 0 1 0 国家计量校准规范编写规则J J F1 2 6 5 生物计量术语及定义凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本规范;凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本规范。3 术语J J F1 2 6 5定
5、义的及以下术语和定义适用于本规范。3.1 等量可溶性荧光分子 m o l e c u l e so f e q u i v a l e n t s o l u b l e f l u o r o c h r o m e,ME S F颗粒发出的荧光信号强度相当的可溶性荧光素分子的物质的量浓度。用于表示颗粒发出的荧光信号强度。4 概述流式细胞仪由液流系统、光学系统、检测系统和分析系统四部分组成(见图1)。测量原理为鞘液和样品流在喷嘴附近组成一个圆柱流束,与水平方向的激光束垂直相交,染色的细胞受激光照射后发出荧光或产生散射光,这些信号分别被光电倍增管荧光检测器和光电二极管散射光检测器接收,经过计算机
6、储存、计算、分析这些数字化信息,就可得到细胞的大小、活性、核酸含量、酶和抗原的性质等物理和生化指标。5 计量特性5.1 分辨力5.2 线性相关系数5.3 检出限5.4 漂移5.5 重复性5.6 示值误差1J J F1 6 6 52 0 1 7图1 流式细胞仪组成示意图6 校准条件6.1 环境条件实验室环境应当满足仪器厂家的安装要求:环境温度(1 53 0);相对湿度7 0%。6.2 标准物质和校准设备6.2.1 标准物质单一荧光强度的荧光微球标准物质;多重荧光强度混合荧光微球标准物质;计数荧光微球标准物质;淋巴细胞计数标准物质。校准时应采用有证标准物质,相对扩展不确定度不超过2 0%(k=2)
7、。6.2.2 化学试剂去离子水(1 8.2Mc m,0.2 2m滤膜过滤);0.1m o l/L磷酸钠缓冲液p H(7.27.4)。6.2.3 校准设备移液器,量程(2 0 010 0 0)L,B级及以上。校准设备需经检定合格。2J J F1 6 6 52 0 1 77 校准项目和校准方法7.1 分辨力仪器经预热,进入正常工作状态。在装有0.5m L经过0.2 2m滤膜过滤的磷酸盐缓冲液的试管中,移取0.5m L单一荧光强度的荧光微球标准物质,充分混匀后上机实验。记录前向角散射光和4 8 8n m激发下两个荧光通道,包括绿色荧光(F I T C异硫氰酸荧光素)、橙红色荧光(P E藻红蛋白)。收
8、集门内有效信号1 00 0 0个,按式(1)计算前向角散射光和两个荧光通道中校准微球峰宽的相对标准偏差(R S D),以表示分辨力。R S D=1 0 0%(1)式中:R S D 相对标准偏差,%;颗粒分布的标准差;颗粒分布的平均值。7.2 线性相关系数在装有1m L经过0.2 2m滤膜过滤的磷酸盐缓冲液的试管中加入2 0L多重荧光强度混合荧光微球标准物质,充分混匀后上机实验,记录4 8 8n m激发下绿色荧光(F I T C)、橙红色荧光(P E)通道信号。对试验结果进行直方图分析,荧光强度从低到高至少5种不同的荧光强度峰(峰的数量和强度取决于所采用的多重荧光强度水平标准微球标准物质),每个
9、峰收集1 00 0 0个门内有效信号,得到每个峰的平均荧光强度。根据校准微球标准物质证书提供的各个峰的等量可溶性荧光分子(ME S F),将各峰的ME S F取对数l g(ME S F),简化表示为y,各峰测量的平均荧光强度取对数l g(F I T C)或l g(P E),简化表示为x,将两者线性回归得到方程y=k x+b,按式(2)分别计算两个通道的线性相关系数(r)。r=ni=1(xi-x)(yi-y)ni=1(xi-x)2ni=1(yi-y)2(2)式中:r 线性相关系数;xi 第i个峰的荧光强度的对数值;x 每个峰的荧光强度的对数值的平均值;yi 多重荧光强度混合微球标准物质中各个水平
10、的荧光微球的ME S F的对数值;y 多重荧光强度混合微球标准物质中的荧光微球的ME S F的对数值的平均值;n 峰的个数。3J J F1 6 6 52 0 1 77.3 检出限针对绿色荧光(F I T C)和橙红色荧光(P E)荧光通道,采用方法7.2中得到的线性回归方程y=k x+b,按式(5)计算无荧光标记的空白微球的平均荧光强度值对应的ME S F即为荧光检出限(L O D)。线性回归方程的斜率k为:k=ni=1(xi-x)(yi-y)ni=1(xi-x)2(3)截距b为:b=y-kx(4)则检出限(L O D)的计算公式为:l g(L O D)=k x0+b(5)式中:L O D 检
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