DB63-T 1693-2018青海藏羊胚胎玻璃化冷冻制作规程-(高清版).pdf
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1、 ICS 65.020.30 B 43 备案号:60857-2018 DB63 青海省地方标准 DB 63/T 16932018 青海藏羊胚胎玻璃化冷冻制作规程 2018-09-25 发布 2018-12-01 实施 青海省质量技术监督局 发 布 DB 63/T 16932018 I 前 言 本规程按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由青海省农牧厅提出并归口。本标准起草单位:青海省家畜改良中心。本标准起草人:莫延新、谢秀梅、冯宇诚、张晋青、补海平、袁海洲、王廷艳、杨玉芹、李梦怡、谭建宁、扈添琴、潘顺利、马元梅、胡宁玺、白坤云。DB 63/T 16932018 1 青海藏羊胚胎玻
2、璃化冷冻制作规程 1 范围 本标准规定了青海藏羊胚胎玻璃化冷冻制作过程中供体羊的选择和饲养管理、超数排卵、准备工作、手术冲胚、胚胎质量鉴定、胚胎玻璃化冷冻、标记和贮存。本规程适用于青海省高原型、山谷型、欧拉型藏羊冷冻胚胎制作。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 5458 液氮生物容器 NY/T 1674 胚胎质量检测技术规程 DB63/T 039 青海藏羊 DB63/T 547.1 青海藏羊饲养管理技术规范 3 术语及定义 下列术语和定义适用于本
3、文件。3.1 供体羊 提供胚胎的羊个体。3.2 超数排卵 利用生殖激素提高供体羊同期卵泡发育数量和卵子数量的技术。3.3 冲胚 配种后第7 d,用冲卵管等装置,把供体母羊子宫内的胚胎冲洗出来的过程。3.4 检胚 对胚胎进行清洗、质量鉴定和分级的过程。3.5 DB 63/T 16932018 2 超低温保存 胚胎放置在液氮中长期保存。3.6 胚胎玻璃化冷冻 应用高浓度防冻剂,使胚胎内外液的同源晶核形成温度与玻璃态转化温度基本接近,控制防冻剂与胚胎的平衡时间和温度,使防冻剂对胚胎毒性降低到最低程度。胚胎内外液能迅速转化形成玻璃体,直接投入液氮中保存。4 种公羊的选择和饲养管理 4.1 种公羊的选择
4、 体型外貌评价、生长发育等指标符合DB63/T 039要求,具有种用价值,体质健康无疫病。4.2 种公羊的饲养管理 种公羊按照DB63/T 547.1规定,补充优质蛋白质、维生素A、维生素E及无机盐等矿物质,做到科学饲喂,适当运动,保证中等膘情,在本交前不宜吃的过饱。5 供体羊的选择和饲养管理 5.1 供体羊的选择 体型外貌评价、生长发育等指标符合DB63/T 039要求,生殖机能正常,体质健康无疫病。5.2 供体羊的饲养管理 供体羊在采胚前后按照DB63/T 547.1规定,对供体羊补充能量、蛋白质、维生素和矿物质,并供给充足清洁饮水,做到科学饲喂,保证中等膘情。6 超数排卵 6.1 超数排
5、卵时间 供体羊超数排卵开始处理时间,应在诱导发情的第9 d进行。6.2 超数排卵性腺激素选择 促卵泡素(FSH)、促黄体素释放激素A3(促排3号)、氯前列烯醇(PG)、孕激素阴道栓塞(CIDR)。6.3 超数排卵处理方法 超数排卵方法:促卵泡素多次注射法(FSH多次注射法)。首先放置阴道栓塞,以放置阴道栓栓塞为发情周期第0 d,从第9 d开始,每天上、下午间隔12 h采用逐渐减量的方法肌注促卵泡素(FSH),连续注射4 d,注射第6针促卵泡素(FSH)时同时注射氯前列稀醇(PG)0.2 mg,在注射第7针促卵泡素(FSH)时取出阴道栓。DB 63/T 16932018 3 剂量:根据促卵泡素(
6、FSH)药用剂量,依据供体母羊体重增减。6.4 发情鉴定及配种 在第12 d下午注射最后一针促卵泡素(FSH)时,即对供体羊进行发情鉴定,用试情公羊进行试情,每20只供体母羊放1只试情公羊,以供体羊站立接受爬跨并完成本交过程为止,间隔8 h 12 h再配1次,连续配种2次3次,同时,对供体羊每次配种结束后注射促黄体素释放激素A3(促排3号)20 g 和维生素ADE 3 ml,做好标记与记录。7 确定冲胚时间 配种后的第7 d从子宫回收胚胎。8 准备工作 8.1 手术室要求 胚胎采集要在专门的手术室内进行,手术室要求洁净明亮,光线充足,面积宜大于15 m2以便于操作。配备照明用电,室内温度保持在
7、20 25,手术前用紫外灯照射1 h 2 h。8.2 供体羊准备 供体羊手术前停食12 h,供给适量饮水。8.3 术者准备 术者剪短指甲,用指刷、肥皂水清洁,并进行消毒,术者需穿清洁手术服,戴工作帽和口罩。8.4 冲胚主要器械药品 8.4.1 器械设备 液氮罐、手术保定架、恒温水浴锅、高压消毒锅、超声波洗涤仪、1000 ml容量瓶、超纯水器、电热鼓风干燥箱、体视镜、羊用二通式冲卵管、滞留针、集卵杯、手术器械、创伤巾。8.4.2 药品 酒精、碘酊、新洁尔灭、0.9%生理盐水、盐酸普鲁卡因青霉素、麻醉剂、清醒剂、氯前列烯醇(PG)。8.5 冲胚保存液的配制 含犊牛血清的杜氏磷酸盐缓冲液。杜氏磷酸盐
8、缓冲液(PBS)配制方法见附录A。9 手术冲胚 9.1 供体羊的保定和麻醉 供体羊仰放在手术保定架上,四肢固定,通过肌肉注射药物进行全身麻醉处理。9.2 手术部位及其消毒 DB 63/T 16932018 4 手术部位在乳房前腹中线与后肢股内侧的交汇处。经剃毛和清水清洗手术部位后,涂以2%的碘酒做消毒处理,待干后再用75%的酒精棉脱碘,盖上创伤巾。9.3 手术操作 9.3.1 组织分离 避开血管,在手术部位纵向切开5 cm 8 cm长的切口,切口方向与组织走向尽量一致,肌肉切开采用钝性分离。9.3.2 引出子宫角和输卵管 切开后,在与骨盆腔交界的前后位置触摸子宫角,摸到后用二指夹持,引出子宫角
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