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基因组编辑技术专题基因组编辑技术专题DiFanNov.12th,2015自从证明DNA是遗传物质以后，人类就开始了通过改变DNA来改造生物体生理机理和功能的尝试。1973 1973年，斯坦利年，斯坦利N N科恩科恩(Stanley N.Cohen)(Stanley N.Cohen)和赫伯特和赫伯特WW博耶博耶(Herbert W.Boyer)(Herbert W.Boyer)成功将蛙的成功将蛙的DNADNA插入到细菌中。插入到细菌中。20 20世纪世纪7070年代，基因泰克年代，基因泰克(Genetech)(Genetech)公司对大肠杆菌进行基因改造，公司对大肠杆菌进行基因改造，使其带有一个人源基因使其带有一个人源基因(这个基因是人工合成的这个基因是人工合成的)，最后生产出治疗糖尿，最后生产出治疗糖尿病的胰岛素。病的胰岛素。19741974年，加利福尼亚州索克生物研究所年，加利福尼亚州索克生物研究所(Salk Institute for Biological(Salk Institute for Biological Studies)Studies)的的Rudolf JaenischRudolf Jaenisch通过将通过将SV40 SV40 病毒的病毒的DNADNA注射到小鼠的囊胚中注射到小鼠的囊胚中,培育出了第一只转基因小鼠。培育出了第一只转基因小鼠。基因突变技术：物理诱变、化学诱变基因突变技术：物理诱变、化学诱变转基因技术：转基因技术：T-DNAT-DNA插入插入RNARNA干扰技术：干扰技术：dsRNAdsRNA、Artificial miRNAArtificial miRNA核外遗传技术：质粒、人工染色体核外遗传技术：质粒、人工染色体同源重组技术：同源重组技术：e.g.e.g.传统的基因敲除小鼠传统的基因敲除小鼠1.1.无法控制突变位点无法控制突变位点2.2.不能精确控制外源基因插入位点不能精确控制外源基因插入位点3.3.对靶基因抑制不彻底、不特异对靶基因抑制不彻底、不特异4.4.难以稳定的遗传难以稳定的遗传5.5.费时费力费钱，难以大量应用费时费力费钱，难以大量应用并引起一系列生物伦理的问题并引起一系列生物伦理的问题现现 状状基因组编辑技术基因组编辑技术基因组编辑技术（基因组编辑技术（genome editing）是一种可以在基因组水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。也称为基因打靶（Genetargeting）。技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。历史历史p1993年前ZFN就已开始出现，迄今已发展了20多年才有今天的成就；p2009年底出现的TALEN似乎一夜之间呈现出取代ZFN的架势；p2012年底CRISPR/Cas已显现出取代TALEN的巨大潜力，在2013年成为现实。荣誉荣誉2011年：ZFN，TALEN和Meganuclease2011年度方法（NatureMethods）2012年：TALEN2012年十大突破（Science）2013年：CRISPR/Cas被认为是诺贝尔奖级别的成果，华人科学家张峰已因此获得生物医学大奖。基因组编辑技术基因组编辑技术应用应用p基因组巡航导弹，分子剪刀，DNA外科医生p定点突变，定点修饰（包括得到转基因），转录调控p基因治疗（如遗传病）基因编辑的三大利器基因编辑的三大利器ZFN(Zinc-fingernucleases,ZFN)TALEN（transcriptionactivator-likeeffectornucleases)CRISPR/Cas(clusteredregulatoryinterspacedshortpalindromicrepeat/Cas-basedRNA-guidedDNAendonucleases）特异性特异性DNA识别域识别域非特异性非特异性核酸内切酶核酸内切酶+8ZFN原理原理ZFN=蛋白的蛋白的DNA识别域识别域+核酸内切酶核酸内切酶DNA识别域：识别域：由由一一系系列列 Cys2-His2锌锌指指蛋蛋白白（zinc-fingers）串串联联组组成成（一一般般34个个），每每个个锌锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基。9核酸内切酶：核酸内切酶：非特异性核酸内切酶非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链，形成二聚体时切割双链DNA 两条两条ZFN之间具有被称为之间具有被称为“间隔区间隔区”的的spacer结构，该结构的长度以结构，该结构的长度以56bp为为宜，宜，7bp也能正常工作，合理的也能正常工作，合理的“间隔区间隔区”设计才能保证设计才能保证ZFN二聚体拥有最佳二聚体拥有最佳的工作空间。的工作空间。ZFN技术的缺陷技术的缺陷DNADNA识别域虽然具有较强的特异性识别能力，但是其识别的序列长度识别域虽然具有较强的特异性识别能力，但是其识别的序列长度比较有限。比较有限。因为因为ZFNZFN剪切的过程不完全依赖同源二聚体的形成，所以一旦形成异剪切的过程不完全依赖同源二聚体的形成，所以一旦形成异源二聚体，就很可能造成脱靶效应；源二聚体，就很可能造成脱靶效应；如果出现脱靶，可能导致如果出现脱靶，可能导致DNADNA的错配和序列改变，产生较强的细胞毒的错配和序列改变，产生较强的细胞毒性。当这些不良影响积累过多，超过细胞修复机制承受的范围时，便性。当这些不良影响积累过多，超过细胞修复机制承受的范围时，便会引起细胞的凋亡。会引起细胞的凋亡。另一方面，该手段在细胞内部操作的精确程度不足，则可能会引起相另一方面，该手段在细胞内部操作的精确程度不足，则可能会引起相关基因突变，引发癌症等。关基因突变，引发癌症等。ZFN ZFN 作为基因治疗的手段之一，如果在生物体内使用，可能会引发免作为基因治疗的手段之一，如果在生物体内使用，可能会引发免疫反应。而现有的研究手段尚不能预测引入的疫反应。而现有的研究手段尚不能预测引入的ZNFZNF蛋白是否会引起免蛋白是否会引起免疫系统的进攻。疫系统的进攻。到目前为止，到目前为止，ZFNZFN技术只能用于体外操作（技术只能用于体外操作（in vitroin vitro），在对人体提取），在对人体提取的细胞进行处理之后，再导入回输到病人体内。的细胞进行处理之后，再导入回输到病人体内。TALENTALEN TALE（Transcription activator-like effectors）:一种源于植物致病菌的靶向基一种源于植物致病菌的靶向基因操作技术。因操作技术。科学家发现，来自植物细菌科学家发现，来自植物细菌Xanthomonas sp.(黄单胞菌黄单胞菌)的的TAL蛋白的核酸结蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系,一个模块单元一个模块单元识别一个碱基，简单且特异性极好。识别一个碱基，简单且特异性极好。通过组合各类模块，可对任意核苷酸序列进行靶向特异性敲除或内源基因通过组合各类模块，可对任意核苷酸序列进行靶向特异性敲除或内源基因的表达调控。的表达调控。目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑马鱼、拟南芥及酵母等多类物种中目前已在人、大鼠、小鼠、猪、羊、斑马鱼、拟南芥及酵母等多类物种中得到成功应用。得到成功应用。TALEN原理典型的典型的 TALEN由一个包含核定位信号（由一个包含核定位信号（NLS）的）的N端结构域、一个包含可识别特定端结构域、一个包含可识别特定 DNA序序列的典型串联列的典型串联TALE重复序列的中央结构域，以及一个具有重复序列的中央结构域，以及一个具有FokI核酸内切酶功能的核酸内切酶功能的C端端结构域组成。结构域组成。DNA识别域：由一系列识别域：由一系列TAL蛋白串联组成（一般蛋白串联组成（一般20个左右），每个个左右），每个TAL蛋白识蛋白识别并结合一个对应的碱基。别并结合一个对应的碱基。核酸内切酶：核酸内切酶：非特异性核酸内切酶非特异性核酸内切酶FokI，形成二聚体时切割双链，形成二聚体时切割双链DNA全长为全长为34aa的的Tal 蛋白的第蛋白的第12、13位氨基位氨基残基可以特异性识别核苷酸碱基残基可以特异性识别核苷酸碱基。NG可以识别可以识别T HD可以识别可以识别C NI可以识别可以识别A NN可以识别可以识别G或或A通过这种特异性识别，将多个通过这种特异性识别，将多个Tal蛋白组蛋白组装在一起，就可以构成可以识别目的片装在一起，就可以构成可以识别目的片段的段的Tale蛋白。蛋白。TALEN原理原理TALENTALEN的特异性打靶的原理：的特异性打靶的原理：一对可以特异性识别靶基因的一对可以特异性识别靶基因的TALETALE，定位到需要编辑的基因组区域；，定位到需要编辑的基因组区域；然然后后非非特特异异性性核核酸酸内内切切酶酶FokIFokI切切断断双双链链DNADNA从从而而造造成成DNADNA双双链链断断裂裂（double-double-strand breakstrand break，DSBDSB）；）；再通过再通过DNADNA的自我修复，引起碱基的缺失或突变，从而引起基因突变。的自我修复，引起碱基的缺失或突变，从而引起基因突变。FokIFokI只有在形成二聚体的时候才有内切酶活性。只有在形成二聚体的时候才有内切酶活性。TALEN原理原理构建特异性的构建特异性的TALENTALEN表达载体表达载体TALEN介导的基因编辑TALEN质粒对共转入细胞后，表达两个融合蛋白，分别与靶位点特异结合，质粒对共转入细胞后，表达两个融合蛋白，分别与靶位点特异结合，由于两个由于两个TALEN融合蛋白中的融合蛋白中的Fok I临近，形成二聚体，发挥非特异性内切临近，形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA。形成形成DSB时，同源重组可将需要敲入的序列组合入基因组。时，同源重组可将需要敲入的序列组合入基因组。17TALEN元件的优化元件的优化TALENTALEN的技术特点的技术特点任意敲除，无基因序列、细胞、物种限制，永久失活任意敲除，无基因序列、细胞、物种限制，永久失活成功率高，在保证转染效率的前提下，有效性可达成功率高，在保证转染效率的前提下，有效性可达95%95%以上以上打靶效率高，可完全替代打靶效率高，可完全替代RNAiRNAi技术技术脱靶率低，尚未发现明显脱靶效应脱靶率低，尚未发现明显脱靶效应技术简单，只需按照常规构建质粒方法构建技术简单，只需按照常规构建质粒方法构建TalenTalen质粒质粒Fighting invasion.Whenviruses(green)attackbacteria,thebacteriarespondwithDNA-targetingdefensesthatbiologistshavelearnedtoexploitforgeneticengineering.Invasion.Streptococcus thermophilus(嗜热链球菌)suchasthisonemayacquirekeydefensivesequencefrominfectiousbacteriophage,attachedattop.LactoseLacticacid发现发现CRISPR-Cas主要由两部分组成：主要由两部分组成：1CRISPR-Cas系统的发现系统的发现CRISPR（成簇、规律间隔的短回文重复序列）-Cas是很多细菌是很多细菌和大部分古生菌的天然存在免疫系统，通过对入侵的病毒和大部分古生菌的天然存在免疫系统，通过对入侵的病毒和核酸进行特异性的识别的一种获得性免疫机制。和核酸进行特异性的识别的一种获得性免疫机制。识别识别切割切割埃马纽埃尔卡彭蒂耶EmmanuelleCharpentier珍妮弗杜德娜JenniferDoudnaBreakthroughPrizeinLifeSciences1CRISPR-Cas系统的发现系统的发现免疫过程免疫过程251CRISPR-Cas系统的发现系统的发现CRISPR-Cas系系统统赋赋予予原原核核细细胞胞针针对对外外源源DNA特特异异性性免免疫疫,而而这这种种特特异异性性是是由由间间隔隔序序列列（spacer）决决定定的的。在在宿宿主主防防御御噬噬菌菌体体攻攻击击中中，细细菌菌进进化化了了CRISPR介介导导的的适适应应性性免免疫疫。这这种种免免疫疫功功能能的的发发挥挥是是由由CRISPR间间隔隔序序列列的的动动态态性性变变化化，即即通过增加或删除间隔序列（通过增加或删除间隔序列（spacer）来实现的。）来实现的。26CRISPR/Cas系统分类：根据CRISPRCas系统中的Cas蛋白的种类和同源性，可将CRISPRCas系统区分成3种类型：TYPEITYPEIITYPEIII1CRISPR-Cas系统的发现系统的发现2TypeIICRISPR系统系统Cas9随着越来越多的不同菌中的CRISPR系统被发现，研究者们根据他们降解外源的遗传物质的方法，将他们分为了三类。TypeIandTypeIII.这两套系统由于参与的蛋白众多，需要几个复合物共同作用才能发挥作用，使得它不宜操作和改造。PAM:proto-spaceradjacentmotifs(保守的间隔相邻基序)crRNA:CRISPRRNAtracrRNA:trans-activatingCRISPRRNA3.3.人工改造人工改造TypeIICRISPR系统中的Cas9是个核酸酶，这个核酸酶结合两个RNA(crRNA,tracrRNA)就可以切割双链DNA.3.3.人工改造人工改造他们进一步阐明了RNA和目标DNA配对的原则，同时将crRNA-tracrRNA连接成了chimeraRNA，这样只需要Cas9蛋白和一条定制的RNA就可以编辑特性的DNA。2012年JenniferA.Doudna和EmmanuelleCharpentier的这篇Science发现了一个比较简单的CRISPR（TypeII）系统的机理。这一系统就简单多了，一个巨大的160KD的蛋白Cas9利用RNA,就可以完成识别和切割靶向的DNA。3.3.人工改造人工改造他们进一步分析了Cas9作为核酸酶的活性位点：两个核酸酶活性域会分别切割靶DNA的两条链，造成双链断裂。31Nucl.AcidsRes.-2013-DiCarlo-nar_gkt135Cas9gRNA20nt4.4.工作原理工作原理Cas9Cas9蛋白与向导蛋白与向导RNARNA结合、组装的动作是这套位点特异性的基因组修饰过程里结合、组装的动作是这套位点特异性的基因组修饰过程里的限速步骤。的限速步骤。真核系统的应用真核系统的应用1）优化密码子，让Cas9蛋白可以在哺乳动物系统中很好的表达。2）加了核定位序列(NLS)，这样可以把Cas9送到细胞核内进行基因组编辑。3）当然，同时需要表达一个guideRNA，把Cas9定位到靶DNA处。4）CRISPR-Cas系统靶向要求为PAM序列（5-NGG-3），即靶序列后面必须为NGG才能被向导RNA识别，在人类基因组中平均每8个碱基就可以出现一个NGG。利用这个技术，就可以很方便高效廉价地在细胞上做基因编辑：包括敲除、修改、插入。4.4.工作原理工作原理4.4.工作原理工作原理-切割后的处理切割后的处理NHEJ:Non-homologousendjoining非同源性末端接合HDR:Homology-directrepair同源直接修复进一步用进一步用Nickase增加编辑特异性增加编辑特异性因为Cas9介导的靶向主要依赖于guideRNA和目标DNA20左右的碱基的配对，大家开始重视脱靶效应（off-target）。ZhangFengMIT&PKU很快，MIT的张峰在Cell上发表了DoubleNick的方法。Cas9会在目标DNA上切两刀，如果把其中一个核酸酶活性位点突变掉，它就变成了一个切口酶。用两对这样的sgRNA把这种切口酶带到基因组上的特异位点，这样就大大提高了靶向的特异性。4.4.工作原理工作原理354.4.工作原理工作原理CRISPR/Cas9的特点和优势操作简单，靶向精确性更高。操作简单，靶向精确性更高。sgRNA sgRNA 靶向序列和基因组序列必须完全匹靶向序列和基因组序列必须完全匹配，配，Cas9 Cas9 才会对才会对DNA DNA 进行剪切。进行剪切。编码编码sgRNA sgRNA 的序列不超过的序列不超过100bp100bp，因此比构建，因此比构建TALENs TALENs 和和ZENsZENs更简单方便，更简单方便，用于用于CRISPR CRISPR 的的sgRNA sgRNA 识别序列仅需识别序列仅需20 20 个核苷酸。个核苷酸。CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9 系统是由系统是由RNA RNA 调控的对调控的对DNA DNA 的修饰，其基因修饰可遗传。的修饰，其基因修饰可遗传。基因修饰率高，基因调控方式多样，例如敲除、插入、抑制、激活等基因修饰率高，基因调控方式多样，例如敲除、插入、抑制、激活等可实现对靶基因多个位点同时敲除。可实现对靶基因多个位点同时敲除。无物种限制。无物种限制。实验周期短，最快仅需实验周期短，最快仅需2 2 个月，节省大量时间和成本。个月，节省大量时间和成本。36CRISPR技术存在问题和解决方案目前不清楚向导RNA分子的特异性作用机脱靶效应（off-target effect）。Joung的工作显示，与向导RNA序列类似的非靶点DNA片段也能够被切断、激活或 者失活，即存在明显的脱靶效应。新方法解决CRISPR-Cas系统难点 可减弱甚至消除消除脱靶效应 利用计算机模型。调整导向RNA序列的量 计算高目标效应和低脱靶效应间最优平衡点最新研究表明，增长RNA链可以提高RNA的结合效率。所以张峰教授对RNA片段结构进行优化，包含一段稳定的发卡结构，能更有效的引导Cas9发挥作用1）基因敲除：基因敲除：如果想使某个基因的功能丧失，可以在这个基因上产生DSB，NHEJ修复的过程中往往会产生DNA的插入或删除（indel），造成移码突变，从而实现基因敲除。2）特异突变引入：特异突变引入：如果想把某个特异的突变引入到基因组上，需要通过同源重组来实现，这时候要提供一个含有特异突变同源模版。正常情况下同源重组效率非常低，而在这个位点产生DSB会极大的提高重组效率，从而实现特异突变的引入。3）定点转基因：定点转基因：与特异突变引入的原理一样，在同源模版中间加入一个转基因，这个转基因在DSB修复过程中会被拷贝到基因组中，从而实现定点转基因。通过定点转基因的方法可以把基因插入到人的基因组AAVS1位点，这个位点是一个开放位点，支持转基因长期稳定的表达，破坏这个位点对细胞没有不良影响，因此被广泛利用。应用（理论上）应用（理论上）应用（理论上）应用（理论上）转录抑制或转录激活特异性的干扰表观遗传学调控在活细胞中成像DNA位点RNA的操作人体基因治疗生态工程分子生物学工具开发构建突变体库遗传筛选基因组编辑技术改良ElizabethPennisi.The CRISPR Craze.Science23August2013;DOI:10.1126/science.341.6148.833基因组编辑（基于DSB）pNHEJpHDR基因干扰基因激活原理原理设想一下：一设想一下：一个人（个人（Cas9）拿着一把钥匙拿着一把钥匙（gRNA）去开）去开一栋大楼中的一栋大楼中的某个房间。某个房间。41应用应用 水稻水稻Indel(33%)Nature Protocols doi:10.1038/nprot.2014.157测序分析转基因株系测序分析转基因株系3个靶位点突变（体细胞个靶位点突变（体细胞突变形成嵌合体）：突变形成嵌合体）：应用应用 拟南芥拟南芥Schematic Diagram of Assembling Cas9/sgRNA Construct and Selecting Target Sites in PDS1AgrobacteriumWeconstructplasmidsthatcarrying4/3/2/1sgRNAstargetingPtPDS1 gene,respectively.应用应用 杨树杨树应用应用 杨树杨树TheBigFragmentChangesattheDesignedCas9TargetingSitesinPtPDSGeneAbigfragmentinversionmutantofPtPDS1AbigfragmentdeletionmutantofPtPDS1应用应用 杨树杨树应用应用 果蝇果蝇A.Bassett,J.-L.Liu/Methods69(2014)128136HRMA:High-resolutionmeltinganalysis(高分辨率熔解曲线分析)A.Bassett,J.-L.Liu/Methods69(2014)128136应用应用 果蝇果蝇whitegeneyellowgene应用应用 HIV HIVDeletion(190bp)LTR:longterminalrepeatsProcNatlAcadSciUSA.2014Aug5;111(31)清除感染细胞中的HIV应用应用 HIV HIVICC:Immunocytochemistry免疫细胞化学技术WB:WesternblotMOI:multiplicityofinfection感染复数ProcNatlAcadSciUSA.2014Aug5;111(31)预防再度感染应用应用 医药医药ChemBiol.2015Jan22;22(1):107-16Drug-targetinteractionXPO-1C528SmutationintheXPO1geneconferscellswithresistancetoselinexor(KPT-330)应用应用 医药医药应用应用 激活基因激活基因53Precise cuts.Injust8months,CRISPRmodificationsofDNAresultedindumpiernematodes(left),zebrafishembryoswithanexcessofventraltissue(middle),andfruitflieswithdarkeyes(right),demonstratingitsbroadutilityforeditinggenesinanimals.