DB44_T 2337-2021实验动物 病原菌PCR定性分析.pdf
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1、 ICS 65.020.30 CCS B 44 44 广东省地方标准 DB44/T 23372021 实验动物 病原菌 PCR 定性分析 Laboratory animals Qualitative analysis of pathogenic bacteria with polymerase chain reaction method 2021-10-18 发布 2022-01-18 实施 广东省市场监督管理局 发 布 目次 前言.II 1 范围.1 2 规范性引用文件.1 3 术语和定义.1 4 缩略语.1 5 原理.2 6 主要设备和材料.2 7 试剂.2 8 方法.3 9 结果.6 1
2、0 防止交叉污染的措施.7 附录 A(规范性)溶液的配制.8 附录 B(规范性)引物及探针序列.10 参考文献.13 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分:标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由广东省科学技术厅提出并组织实施。本文件由广东省实验动物标准化技术委员会(GD/TC 93)归口。本文件起草单位:广东省实验动物监测所。本文件主要起草人:闵凡贵、潘金春、黄树武、王静、袁文、何丽芳、陈梅玲、张钰、黄韧。实验动物 病原菌 PCR 定性分析 1 范围 本文件规定了实验动物病原菌的PCR
3、定性分析方法。本文件适用于实验动物病原菌核酸定性分析。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 14926 实验动物 微生物检测方法 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 GB/T 19495.2 转基因产品检测 实验室技术要求 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。聚合酶链式反应 polymerase chain reaction,PCR 体外酶催化合成特异DN
4、A片段的方法,模板DNA先经高温变性成为单链,在DNA聚合酶作用和适宜的反应条件下,根据模板序列设计的两条引物分别与模板DNA两条链上相应的一段互补序列发生退火而相互结合,接着在DNA 聚合酶的作用下以四种dNTP为底物,使引物得以延伸,然后不断重复变性、退火和延伸这一循环,使欲扩增的基因片段以几何倍数扩增。实时荧光聚合酶链式反应 real-time PCR,实时荧光 PCR 实时荧光PCR方法是在普通PCR的基础上,在反应体系中加入特异性荧光探针,利用荧光信号积累实时报告整个PCR进程,通过读取每次循环反应中的荧光发射信号,间接反映了PCR扩增的目标基因的量,最后通过扩增曲线对未知模板进行定
5、性或定量分析。Ct 值 cycle threshold 实时荧光PCR反应中每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。DNA 脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid)EDTA 乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid)PBS 磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline)RNA 核糖核酸(ribonucleic acid)TAE 三羟甲基氨基甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸缓冲液(tris-acetate-EDTA)5 原理 用合适的方法提取样本中的DNA,分别针对病原菌16s
6、RNA或其他保守的基因设计特异的引物探针序列,通过PCR对模板进行扩增,根据PCR反应结果分析该样品中是否含有某种病原菌。6 主要设备和材料 PCR 仪。实时荧光 PCR 仪。电泳仪。凝胶成像分析系统。高速冷冻离心机。普通离心机。恒温孵育器。漩涡振荡器。组织匀浆器。微量核酸定量仪。生物安全柜。PCR 超净工作台。冰箱(-20)。微量移液器:0.1 L2 L,1 L10 L,10 L100 L,100 L1000 L。灭菌离心管(1.5 mL、2 mL、5 mL、15 mL),灭菌吸头(10 L,200 L,1 mL),灭菌 PCR 扩增反应管(0.2 mL,八连管或 96 孔板)。聚乙烯薄膜袋
7、:90 mm150 mm 自封袋,使用前紫外灭菌 20 min。采样工具:剪刀、镊子和灭菌棉拭子等。7 试剂 以下所用的试剂除特别注明者外均为分析纯,所用的水为双蒸水或去离子水,应符合 GB/T 6682所规定一级水的要求。所有涉及分子生物学操作的水均为无 DNA 酶、无 RNA 酶水。灭菌 PBS。配制方法见附录 A。DNA 抽提试剂:基因组 DNA 提取试剂盒 DNeasy Blood&Tissue Kit 或其他类似产品。注:DNA提取试剂盒是由Qiagen公司提供的DNeasy Blood&Tissue Kit。给出这一信息是为了方便本文件使用者,并不表示对这一产品的认可。亦可使用其他
8、类似的DNA提取试剂盒进行。无水乙醇。PCR 试剂:Premix Taq TM(Version 2.0 plus dye)、Premix Ex Taq(Probe qPCR)或其他类似产品。注:以上PCR试剂是是由Takara公司提供的商品试剂盒,是本文件适合的市售产品的使用实例,给出这一信息是为了方便本文件使用者,并不表示对这一产品的认可。亦可使用其他类似的PCR试剂。DNA 相对分子质量标准:100 bp2 000 bp。50TAE 电泳缓冲液,配制方法见附录 A。溴化乙锭:10 mg/mL,配制方法见附录 A,或其他类似产品。1.5%琼脂糖凝胶,配制方法见附录 A。引物和探针:根据附录
9、B 中表 B.1 和表 B.2 的序列合成引物和探针,引物和探针加入无 DNA 酶、无 RNA 酶水配制成 10 mol/L 储备液,置于-20 保存,使用的工作液应当置于 4 存放,避免引物或探针由于反复冻融出现降解。8 方法 生物安全措施 对于可能潜在人兽共患病的样本,应在生物安全二级及以上实验室进行操作,采样应在生物安全柜中进行。实验操作及处理按照GB 19489的规定,由具备相关资质的工作人员进行相应操作。采样及样本的处理 采样过程中样本不得交叉污染,采样及样本前处理过程中须戴一次性手套。采样及样本处理过程操作人员应做好个人防护。8.2.1 脏器组织 剖检,无菌采集动物脏器,剪取待检样
10、本0.5 g2 g,加入5倍体积灭菌PBS,使用匀浆器充分匀浆1 min2 min,然后将组织悬液在4,8 000 g离心10 min,取上清液转入另一无菌5 mL离心管中,编号备用。8.2.2 细菌培养物 参照国标GB/T 14926对临床样本进行细菌分离培养,获得可疑阳性培养物,刮取约1 mm23 mm2菌苔,加入500 L无菌水混匀,煮沸后,8 000 g离心1 min,取上清液直接进行PCR。8.2.3 盲肠内容物或粪便 无菌采集动物盲肠内容物或粪便,取待检样本0.5 g2.0 g,加入5倍体积灭菌PBS,使用匀浆器充分匀浆1 min2 min,8 000 g离心5 min,取上清液取
11、离心上清液转入另一无菌离心管中,编号备用。8.2.4 血液样本 无菌采集动物血液0.2 mL0.5 mL,加入柠檬酸钠或EDTA抗凝管中,轻轻颠倒混匀3次5次,编号备用。8.2.5 拭子取样 对活体动物取样可采集肛拭子、咽喉拭子、泄殖腔拭子、鼻拭子、皮肤拭子等,浸泡于3 mL无菌PBS中5 min10 min,充分混匀后,4,8 000 g离心5 min,取上清液转入另一无菌5 mL离心管中,编号备用。8.2.6 饲料、垫料和饮水 饲料、垫料:取约5 g10 g饲料和垫料置于50 mL无菌离心管中,加入3倍体积灭菌PBS(饲料和垫料需全部浸泡于液体中)。密封后浸泡5 min10 min,充分混
12、匀,将混悬液转移至15 mL无菌离心管,4,8 000 g离心5 min,取上清液转入另一无菌5 mL离心管中,编号备用。饮水:取200 L1000 L实验动物饮水直接转移到无菌1.5 mL 离心管中,编号备用。8.2.7 设施设备 用灭菌棉拭子拭取实验动物设施设备出风口初效滤膜表面约5 cm2沉积物,将拭子置入灭菌15 mL离心管,加入3 mL灭菌PBS,浸泡5 min10 min,充分混匀,取出棉拭子,将离心管于4,8 000 g离心5 min,取上清液转入另一无菌离心管中,编号备用。8.2.8 样本的存放 采集或处理的样本在2 8 条件下保存应不超过24 h,若需长期保存,须放置于-80
13、 冰箱,但应避免反复冻融。8.2.9 采样废弃物处理 采样结束,动物尸体应使用生物安全垃圾袋包装完整,高压灭菌后交由医疗垃圾处理单位进行处理,采样器材应使用消毒液浸泡或高压灭菌消毒,并做好实验台面及采样室的消毒。核酸提取 8.3.1 取 50 L100 L 的样本至 1.5 mL 或 2 mL 离心管中,加 20 L 蛋白酶 K,用 PBS 补加至 220 L。8.3.2 加入 200 L 缓冲液 AL,涡旋震荡充分混匀,56 孵育 10 min。8.3.3 加入 200 L 的无水乙醇,涡旋震荡充分混匀。8.3.4 移取第 8.3.3 条制备的混合液至离心柱上,离心柱放在 2 mL 收集管上
14、,6 000 g离心 1 min。弃收集管/液。8.3.5 离心柱放至新的 2 mL 收集管上,加 500 L 缓冲液 AW1,6 000 g离心 1 min。弃收集管/液。8.3.6 离心柱放至新的 2 mL 收集管上,加 500 L 缓冲液 AW2,20 000 g离心 3 min。弃收集管/液。8.3.7 将离心柱放在一个新的 1.5 mL 离心管上,吸 200 L 的缓冲液 AE 在吸附膜上,室温孵育 1 min,6 000 g离心 1min。收获提取 DNA 液。8.3.8 取 2 L 提取的 DNA 样本使用微量核酸定量仪测定提取 DNA 浓度。8.3.9 制备好的 DNA 应尽快
15、进行下一步 PCR 反应,若暂时不能进行 PCR 反应,应于-20 冰箱保存备用。注:该DNA提取方法是针对DNA提取试剂盒DNeasy Blood&Tissue Kit给出的应用实例,可使用其他类似的DNA提取试剂盒进行,提取方法可做相应调整。普通 PCR 8.4.1 PCR 反应体系 PCR反应体系见表1。反应液的配制在冰上操作,每次反应同时设计阳性对照、阴性对照和空白对照,其中阳性对照以含有阳性病原菌的组织或培养物提取的核酸作为阳性对照模板,其中阴性对照以不含有阳性病原菌的样本核酸(可以是正常动物组织或正常培养物)作为阴性对照模板,空白对照即为不加模板对照(No Template Con
16、trol,NTC),即在反应中用水来代替模板。表1 PCR 反应体系配制表 反应组份 用量/L 终浓度 2Premix Taq Mix(plus dye)10 1 Forward primer(10 mol/L)0.8 0.4 mol/L1 mol/L Reverse primer(10 mol/L)0.8 0.4 mol/L1 mol/L DNA 模板 2 250 ng PCR 用水 6.4/总体积 20/注1:可使用其他类似的PCR试剂进行,反应体系和反应参数可做相应调整。注2:反应体系可按各反应组份终浓度配比按比例增加或减少。8.4.2 PCR 反应参数 PCR反应参数见表2。表2 PC
17、R 反应参数 步骤 温度 时间 循环数 预变性 95 5 min 1 变性 98 10 s 30 退火 50 60 30 s 延伸 72 1 min/kb 注:各引物退火温度及扩增条参照附录B可作相应调整。8.4.3 PCR 产物电泳分析 将适量50TAE稀释成1TAE溶液,配制含核酸染料溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶。PCR反应结束后,取10 L PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶进行电泳,以DNA分子量作参照。电压大小根据电泳槽长度来确定,一般控制在3 V/cm5 V/cm,当上样染料移动到凝胶边缘时关闭电源。电泳完成后在凝胶成像系统拍照记录电泳结果。实时荧光 PCR 8.5.1 实时荧光 PC
18、R 反应体系 实时荧光PCR反应体系见表3。反应液的配制在冰上操作,每次反应同时设计阳性对照、阴性对照和空白对照,其中阳性对照以含有阳性病原菌的组织或细胞培养物提取的核酸作为阳性对照模板,其中阴性对照以不含有阳性病原菌的样本核酸(可以是正常动物组织或正常细胞培养物)作为阴性对照模板,空白对照即为不加模板对照(No Template Control,NTC),即在反应中用水来代替模板。表3 实时荧光 PCR 反应体系配制表 反应组份 用量/L 终浓度 2Premix Ex Taq Mix 10 1 Forward Primer(10 mol/L)0.4 0.2 mol/L1 mol/L Reve
19、rse Primer(10 mol/L)0.4 0.2 mol/L1 mol/L Probe(10 mol/L)0.8 0.4 mol/L1 mol/L Rox(50)0.2/DNA 模板 2 100 ng PCR 用水 6.2/总体积 20/注1:试剂Rox只在具有Rox荧光校正通道的实时荧光PCR仪上进行扩增时添加,否则用水补齐。注2:可使用其他类似的实时荧光PCR试剂盒进行,反应体系和反应参数可做相应调整。注3:反应体系可按各反应组份终浓度配比按比例增加或减少。8.5.2 实时荧光 PCR 反应参数 实时荧光PCR反应参数见表4。反应结束后,根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。表4 实时
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