旋光色散和圆二色光谱市公开课一等奖百校联赛获奖课件.pptx

7旋光色散和圆二色光谱旋光色散和圆二色光谱第1页OVERVIEW1.A molecule is optically active if it interactsdifferentlywithleftandrightcircularlypolarizedlight.This interaction can be detected either as adifferential change in velocity of the two beamsthrough the sampleoptical rotatory dispersion(ORD)or as a differential absorption of eachbeamcircular dichroism(CD).第2页2.ORDspectraarecharacterizedby，whichisthespecificrotationatagivenwavelength，orthe molar rotation.Both have units ofdegreecm2dmol1.CDspectraarecharacterizedbyA(thedifferentialabsorptionofthetwobeams)orthe molar ellipticity m，which at a givenwavelengthisrelatedtoA.CDorORDbandsareoften referred to as Cotton effects.These can bepositiveornegative.第3页3.CDismorefrequentlyusedthanORDbecauseofsuperiorinstrumentationandtheshapesoftheCDcurves.4.Veryfewchromophoresareintrinsicallyopticallyactive;thosethatareactiveincludetheamidesanddisulfidecystineinproteins.Mostopticalactivityofchromophoresarisesfromopticalactivityinducedbyinteractionswithasymmetricallyplacedneighboringgroups.第4页5.One of the main applications of CD spectra isbasedontheirsensitivitytothesecondarystructureofproteins.Otherusesincludedetectionofconformational changes and measurement of ligandbinding.6.Optical activity can also be induced by theapplicationofamagneticfield，whichperturbstheenergy levels of the system.This is the basis ofmagnetic circular dichroism(MCD).Unlike CD，MCDislargelyinsensitivetomolecularconformation，but it is sensitive to the total concentration ofMCDactivechromophoresandtheirlocalenvironment.第5页7.1 引言引言早在十七世纪，Huggens就发觉了光偏振到了十九世纪，偏振光开始用于分子旋光现象研究Biot1881年发觉石英能使偏振光偏振面旋转，在松节油等液体和一些气体中也发觉了这种效应。Biot在发觉旋光现象同时，还观察到了电气石园二色性。以后将旋光色散与园二色性这两种现象称为科顿效应。第6页十九世纪中期，许多旋光性定律开始公式化，并对十九世纪末有机立体化学和有机结构理论发展起到了直接推进作用。1934年，Lowry出版了第一本完整相关旋光色散书”OpticalRotatoryPower”。1953年Djerasi试验室建立了第一台偏振光检测仪，从此ORD开始广泛地用于研究有机分子和生物大分子。六十年代，园二色谱逐步取代旋光色散方法，成为硕士物大分子溶液构象有力工具。第7页7.2 原理原理7.2.1平面偏振光、圆偏振光和椭圆偏振光当一束平面偏振光(PlanePolarizedLight)经过某种物质传输时，若出射光偏振面相对于入射光偏振面旋转一定角度，这种物质称之为光光学学活活性性物物质质(Optically active substance)或手手性性物物质质(chiralsubstance)。这种性质则称为光光学学活活性性(opticalactivity)或手征性手征性(chirality)。光学活性物质除使入射到它上面并经过它传输平面偏振光偏振面旋转一定角度之外(称为“旋旋光光”)，还会存在光吸收各向异性，称为“圆圆二二色色性性(circulardichroism)。第8页活生物体所含有分子差不多都含有光学活性。小分子光学活性起源于其结构不对称性，尤其是分子中存在不对称碳原子以及这些原子对附近生色团(chromophore)影响。生物大分子构象与其所表现出来生物活性有着亲密关系，所以旋光性和园二色性测量技术是硕士物大分子构象及其功效间关系主要伎俩。第9页光是横波，其电场矢量E和磁场矢量H与光传输方向均垂直。若光波电矢量E(以及磁矢量H)取全部可能方向，而没有一个方向较其它方向占优势，这种光称为自然光(图1(a)。因为光波产生感光作用主要是电场E引发，因而普通就把电场矢量E为光波振动矢量。该振动矢量与光波传输方向所决定平面叫做振动面。当自然光入射到一些材料后，出射光就变为其振动面确定光，叫做平面偏振光平面偏振光或线偏振光线偏振光(图1(b)。平面偏振光电矢量E方向和电传输方向所决定平面，叫偏振面偏振面(Polarizedplane)。第10页图1.Directionsoftheelectricvectorinpolarizedandunpolarizedlight.Inunpolarizedlight(a)，orpartlypolarizedlight(c)，theoscillationstakeplaceatallangles perpendicular to the direction of travel;inpolarizedlight(b)theyarerestrictedtooneangle.第11页以下列图所表示两个频率和振幅相同，偏振面相互垂直平面偏振光，假如其相位差90，则它们合成为一个圆圆偏偏振振光光。图2左旋园偏振光第12页图3右旋园偏振光第13页图4椭园偏振光第14页E0ji一束平面偏振光能够分解为两束振幅、频率相同，旋转方向相反圆偏振光(Circularpolarizedlight)，如图所表示E=E0cost=j E0cost=Er+ElEr1/2(+iEsint+jEcost)(5)El1/2(iEsint+jEcost)(6)其中E为平面偏振光电场矢量振幅，为其角频率，i和j为轴和轴上单位矢量。右旋园偏振光电场矢量Er之端点在空间轨迹是以光传输方向为轴左手螺旋，而左旋园偏振光El之端点在空间轨迹是以光传输方向为轴右手螺旋，它们振动面随时间而旋转。一个平面偏振光能够用下面方程表示:E=E0cost=jE0costi，j分别为X，Y座标轴方向上单位矢量。第15页7.2.2 旋光(Optical Rotation)、旋光色散(OpticalRotatoryDispersion，ORD)和圆双折射(CircularBirefrigence)。光在经过不一样物质时，其传输速度会发生改变，定义光在真空中速度C0与在某种物质中速度v之比为折射率n，即n=C0/v。假如某种物质对于左旋偏振光和右旋偏振光折射率nlnr，则左旋光和右旋光旋转速度会有所不一样，它们和与原来没有样品时相比旋转了一个角度(见图)，这种现象称为旋旋光光。面对入射光，使入射光偏振方向顺时针旋转物质叫右旋物质右旋物质，使入射光偏振方向逆时针旋转物质叫左旋物左旋物质质，习惯上用+号表示右旋物质，用号表示左旋物质。第16页对于光学各向异性物质，它对左旋园偏振光和右旋园偏振光折射率nl和nr是不一样，二者之差=nlnr称为圆圆双折射双折射。因为c:为真空中光速，v:为光在介质中速度，所以某种物质存在圆双折射，入射平面偏振光之左旋分量和右旋分量将以不一样传输速度经过介质，经过该物质后，二者之间存在一定相位差，若该介质对左旋分量和右旋分量吸收相同，出射两束圆偏振光分量将重新合成平面偏振光(而不是圆偏振光或椭圆偏振光），如图6（b）所表示，其偏振面与入射平面偏振光之偏振面间夹角为。第17页图6(a)园二色产生：样品对左旋L和右旋R两个园偏振分量吸收不一样，合成为椭圆偏振光；（b）园双折射和旋光现象：样品对左旋和右旋偏振光折射率不一样即L和R在样品中速度不一样。合成平面偏振光之偏振面旋转了角。第18页经过推导可得到:(弧度)(度)式中为样品厚度，为光波波长。由此我们看出，旋光现象就是一个圆双折射，旋光性本质就是旋光物质含有两个不一样折射率。第19页平面偏振光经过样品后其偏振面旋转角度obs。与光穿透样品厚度l、溶液样品中旋光性物质浓度c成正比(在一定浓度范围内)，且与该光波长、样品温度T有百分比系数T称为比旋比旋(Thespecificrotation)或旋光旋光率率。第20页旋光可用比旋T表示，也可用摩摩尔尔比比旋旋(theMolarRotation)T 或克分子旋光度克分子旋光度表示，二者间关系为:其中MW是溶质分子量，单位为克/摩尔，摩尔比旋量纲为度厘米2分摩尔1。l为光径，单位为分米(dm)，C为浓度，单位为克/毫升。第21页在生物大分子研究中，还惯用平平均均残残基基旋旋光光度度(averageresiduerotation)，其定义为 MRW100其中MRW为平平均均残残基基分分子子量量(meanresidueweight)，即蛋白分子量与残基数之比MWMRW残基数对普通蛋白质分子，该值约为110-115。第22页对于同一物质，比旋或摩尔比旋与入射偏振光波长相关，比旋或摩尔比旋与波长间函数关系称为旋光色散旋光色散。第23页7.2.3圆二色性(CircularDichroism)和椭圆率(ellipticity)当一束光穿过样品时，光强度呈指数规律下降，服从Beer-Lambert定律。log10(I0/It)=Cl其中I0是入射光强度，It是穿过样品后光强度，C是样品浓度，l是光径，是消光系数(extinctioncoefficient)。令A=log10(I0/It)=ClA称为吸收度(absorbance)或光密度(opticaldensity)。第24页当一束平面偏振光经过光学活性介质传输时，因为介质对二分量消光系数l和r不等，即对左旋光和右旋光吸收不一样，一束平面偏振光经过该样品后，其左旋分量和右旋分量强度不再相同，它们和就不再是平面偏振光而是椭圆偏振光。这种现象就叫做“圆二色圆二色(circulardichroism)“（图6a）。第25页因为存在圆二色性，平面偏振光经过光学活性介质后，两圆偏振分量电场矢量大小不一样了(实际上，因为同时存在圆双折射，所以二者位相也不一样)，这么两个大小不一样圆偏振光合成不再是平面偏振光，而是椭圆偏振光(ellipticallyPolarizedlight)，其电场矢量端点在空间轨迹是以光传输方向为轴椭形螺旋(ellipticalhelix)，其振动面随时间也是连续旋转(图4)。第26页我们能够经过深入分析来了解园二色现象。假如lr，则经过光学活性物质样品后，左旋分量振幅不再等于右旋分量振幅。假定左旋分量右旋分量，即ElElEr 1/2(+iErsin+jErcos)El1/2(iElsin+jElcos)Er+Eli(ErEl)sin+j(Er+El)cos这个光电场矢量端点轨迹是一个椭圆，即经过光学活性物质样品后，左旋和右旋偏振光和不再是平面偏振光，而是椭圆偏振光，椭圆长轴在j方向上，长轴为Er+El，短轴在i方向上，短轴为Er El。第27页圆二色可用吸收度差A或消光系数差来表示:A=AlAr称为圆二色性圆二色性()。有文件用摩尔消光系数表示圆二色性=lr(AlAr)Cl上式中l和r分别为左右旋分量摩尔消光值(molarabsorbance)。第28页园二色性大小也可用椭椭圆圆率率来表示。椭圆偏振光电场矢量端点在空间轨迹投影到垂直于光传输方向平面上为一椭圆，此椭圆短轴(theminoraxis)a与长轴(themajoraxis)b之比反正切称为椭圆率:atg-1（弧度）b由理论分析可推出椭圆率和圆二色性间关系为1802.303(AlAr)(度)4第29页与旋光度对应，在实际工作中，还惯用比椭圆率（specificellipticity）、摩尔椭圆率(molarellipticity)和平均残基椭圆率MRW（themeanresicueellipticity）:=其中为测得椭圆率，单位为度，MW为分子量，单位为克/摩尔，MRW为平均残基分子量，l为光径，单位为分米，C为浓度，单位为克/毫升，单位是度厘米2分摩尔-1。第30页当不存在圆二色性时，即l=r时，椭圆短轴为零，变为在长轴方向直线，这正是前面讨论过平面偏振光，不过偏振面相对于入射光偏振面旋转了角度。第31页724科顿效应(Cottoneffect)在光学活性物质整个吸收带内，其旋光色散曲线(ORD)呈S形，而对应圆二色性曲线(CD)呈钟形，这种ORD在吸收带附近异常效应和圆二色性在吸收峰处含有极值现象称为科顿效应(图7)。ORD曲线在较长波长一侧有一峰科顿效应称为正科顿效应，而此侧有一谷称为负科顿效应图7。正科顿效应含有正CD曲线，其峰位在S形ORD曲线凸到凹转折点。第32页图7(a)正科顿效应(b)负科顿效应（参考书图104）第33页从图中能够看出：CD谱带比ORD有更加好分辨率，但ORD谱带两翼看到信息可能是CD无法直接看到。另外，ORD谱是一个色散曲线（反应了折射率随波长改变），所以它与折射系数符号在吸收峰附近改变相关。第34页从图中还能够看出：CD谱带比ORD有以下三个优点：（A）CD谱带比较轻易识别，因为一个有光学活性电子跃迁，其ORD是一个色散曲线，而CD谱只有一个单相谱峰。（B）ORD色散曲线分布波长范围比CD谱宽，即其分辨率不如CD谱高。（C）CD谱在检测技术上比ORD更方便。这一点将在仪器部分介绍。第35页7.2.5 旋光色散与园二色谱关系：旋光色散与园二色谱关系：Kronig-Kramer变换式变换式CD谱与ORD谱是相互关联，实际中，这两种现象总是同时发生，它们之间关系能够用Kronig-Kramer变换式表示:()20()d2()22()20()d2()2第36页7.2.6 THE PHYSICAL BASIS OF OPTICAL ACTIVITYAs we discussedin Chapter 2,transitions from theground state to the excited state involve adisplacementofcharge.Alineardisplacementwithanelectrictransitiondipolemomentisdenotedby.Thetransition can also have a circular component;this(rotating current)then generates a magnetic dipolemomentmperpendiculartotheplaneofthecircularmotion(seeFigure8(a).第37页Opticalactivityrequiresafinite andafinitem.Thiscorrespondstoahelicaldisplacementofcharge.The result is that left or rightcircularlypolarized beams then interact differently with themolecules in solution.These interactions do notaveragetozeroeveninmoleculesrandomlyorientedin solution(compare Linear Dichroism).(Themagnitude of the transition is proportional to thevectorproductof andm).第38页The required helical displacement of charge mayarisefromtheintrinsicnatureofthechemicalbonds,forexample,inann*transition(seeFigure8(b).Chromophoresthathaveintrinsicopticalactivityareoften termed asymmetric.The required helicaldisplacement of charge may also arise from aninduced effect because of the environment of themolecule undergoing the transition.The resultingoptical activity is then often referred to as anextrinsic Cotton effect.第39页Figure 10.6 (a)A helical displacement of charge can beconsidered to comprise a linear displacement plus a circulardisplacement.(b)Rotationandtranslationofchargeinanorbital.第40页OPTICALLY ACTIVE CHROMOPHORESOpticalactivityisobservedonlywhentheenvironment in which a transition occurs isasymmetric.Aninherentlyasymmetricchromophore,suchasthepeptidebond,isalwaysopticallyactiveirrespective of the surrounding groupswhich can,however,modifyitsopticalproperties.第41页In contrast,any optical activity from inherentlysymmetric chromophores is induced and resultsfrom interactions with asymmetrically placedneighboringgroups.Thesignandmagnitudeoftheinduced optical activity(Cotton effects)of aparticular chromophore depend on the localenvironment.第42页Veryfewchromophoresareinherentlyopticallyactive.Inproteins,apartfromtheamidechromophores(240nm),onlythedisulfidecystineisintrinsicallyopticallyactive.The positions of the CD bands from thedisulfidearefoundintherange240-360nm.TheirCDspectra are complex to interpret and depend on theSS dihedral angle and the interactions withneighboring groups.They are not usually resolvablefromtheinducedCDbandsofthenormallyopticallyinactivearomaticsidechains,whichoccurintherange250-310nm.Inducedopticalactivityisalsoobservedinthehemeabsorptiontransitionsofmosthemeproteins and for the metal absorption bands inmostmetalloproteins.第43页Innucleicacids,theindividualbasesofDNAand RNA are not optically active,but theirincorporation into nucleosides or nucleotidesresultsininducedopticalactivity.Theseeffectsdepend on the nature of the base and theglycosidiclinkage.第44页Carbohydrates generally absorb only in thefar ultraviolet,but as instrumentation isimproved,therewillbemoreapplicationsinthisfield.Inpolysaccharides,boththenatureof the individual sugars and the linkagesbetween them are important in determiningtheopticalactivity.第45页三、三、仪器原理仪器原理物质光学活性研究，既能够经过旋光色散(ORD)谱测量进行，也能够经过园二色性(CD)测量进行。不过，CD谱较ORD谱有显著优点，其谱带与吸收带重迭，分子中不一样生色团对于谱贡献比起在ORD中能够更轻易分辨，而在ORD中任意波优点旋光性是分子中全部生色团色散贡献之和。其科顿效应又与吸收峰不一致，解释起来有较大困难。第46页因为科顿效应曲线总是发生在光学活性物质吸收带附近，这时光学活性物质也总是表现出园二色性，所以近年来园二色性研究已基本取代了旋光色散研究，这里也仅介绍园二色性测量仪器原理。园二色性测量，实际上是测量样品对左旋偏振光和右旋偏振光吸收率差值A=ALAR第47页由公式2.303(ALAR)能够计算出椭圆率，进而由公式能够得到摩尔椭圆率。第48页只要将频率、强度完全相同左、右旋偏振光交替地经过样品，分别统计样品对它们吸收值，由式A=ALAR即可得到该频率下圆二色性和椭圆率值，逐步改变左右旋偏振光波长，即对波长进行扫描，即可得到圆二色谱(随改变曲线)。第49页圆二色测量谱仪结构框图第50页光源（S）普通为氙灯，功率在500W左右，在可见波段含有足够光强，且称连续谱。紫外波段虽强度下降，但直至185nm，仍有相当强度，是较理想光源。单色仪（MC）用途是使光源发出各种波长光按要求成为单一波长光波。起偏器（P）作用是使单色光成为平面偏振光。第51页调制器（M）受程序控制系统控制，使透过光以一定频率交替地变为左旋和右旋园偏振光。普通来说，这种调制器是由某种压电晶体制成晶片制成，晶片两面镀上电极，两电极之间加上一交变电压，交变电压电压值按照一定频率周期性地改变时，晶片厚度也随之改变。仪器设计使交流电压峰值处取得园偏振光。当电压经过其正、负峰值时，能够交替地得到左、右旋园偏振光。第52页从调制器出来左旋和右旋园偏振光经过样品后，由检测器（PD）进行检测，然后输入放大器（Amp.）和相敏检测器（PSD），由放大器出来信号直流分量和由相敏检测器出来信号交流分量在运算单元中进行计算，得到A，最终输入数据统计系统。第53页A测量和计算方法前面已经介绍：A=ALAR因为吸收率A式中I0为入射光强度，I为出射光强度第54页因为入射左、右旋园偏振光强度是相等，所以I0LI0R因为IR与IL相差很小，A极难测定。实际仪器中是将平面偏振光引入调制器，调制器是加一高频交变电压。选择适当交变电压和调制器，使得在交变电压峰值处取得园偏振光，当电压经过其正、负峰值时，能够交替地得到左、右旋园偏振光。当光学活性物质插入这园偏振光光路中时，经过样品后光强度随时间改变以下列图，强度改变频率与外加电压频率相同。第55页假如ALAR，则IRIL，即经过样品后右旋园偏振光强度大于左旋园偏振光。当强度这么改变光照射到光电倍增管上时，输出信号中含有AC分量IAC和DC分量IDC。IACIRILIDC第56页假如ALAR，则IRIL，即经过样品后右旋园偏振光强度大于左旋园偏振光。当强度这么改变光照射到光电倍增管上时，输出信号中含有AC分量IAC(图中S)和DC分量IDC(图中IA)。IACIRILIDC第57页当x1，第58页这么，第59页这么，求出就得到了A，也就得到了。当代化CD谱仪，只要将仪器调整到正常工作状态，置样品于光路中，开启仪器，即可自动进行波长扫描(在设定频率区间)，得到CD谱。第60页7.4 园二色谱生物学应用举例园二色谱生物学应用举例第61页7.4.1 氨基酸和多肽园二色性氨基酸和多肽园二色性氨基酸分子内紫外生色基团有吲哚基、酚羟基、苯基、二硫键，咪唑基和羧基。当这些生色基团受到不对称碳原子或其它不对称结构影响时，在它们各自吸收区域里表现出圆二色性。研究氨基酸（主要是芳香族氨基酸和胱氨酸）以及它们衍生物CD性质，为研究蛋白质CD谱提供基本材料。同时，活性肽有主要生理功效，所以肽构象与功效关系是主要分子生物学课题。肽构象也是蛋白质构象一个模型。肽圆二色性为研究肽在溶液中构象提供了许多主要信息。第62页7.4.1.1氨基酸圆二色谱氨基酸圆二色谱7.4.1.1.1 酪氨酸及其衍生物近紫外酪氨酸及其衍生物近紫外CD谱谱酪氨酸及其衍生物在中性水溶液中CD谱都在275nm左右显示CD峰。下列图表示N-乙酸酪氨酸酰胺在水溶液中CD谱。275nm左右峰可正可负，视模型化合物以及所用溶剂而定。在水溶液中，CD峰处椭圆值在660到660间，比普通蛋白质中每个酪氨酸残基CD贡献要小得多。第63页在有机溶剂中或在低温下，酪氨酸及其衍生物CD峰值显著增大。Strickland等得到在低温下酪氨酸衍生物在有机溶剂中CD谱，它们能清楚地显示酪氨酸CD谱振动结构。但即便在室温下水溶液中，普通酪氨酸衍生物CD谱仍能显示一峰一肩（见下列图），肩在峰长波长一侧。溶剂组成改变能影响谱带位置。酪氨酸酚羟基如和其它质子受体组成氢键，则其CD谱会产生较大红移。第64页第65页有些酪氨酸衍生物如N-乙酰-O-甲-酪氨酸乙酯在甲基环己烷中显示CD谱形和其吸收谱形几乎完全一样，这说明这个化合物在此溶剂中以单一构象子（Conformer）存在，但有许多模型化合物在溶液中以处于平衡状态多个构象子存在。每个构象子CD谱各不相同，有正有负。这些CD谱叠加起来，使得观察到CD谱和吸收谱不一致情形出现。酚羟基在碱性溶液中解离时，给出290nm以上CD峰，峰形和峰位与其吸收谐相同。第66页7.4.1.1.2色氨酸及其衍生物近紫外色氨酸及其衍生物近紫外CD谱谱色氨酸近紫外CD谱波长位置不大受溶剂条件影响，普通在288-292nm间。溶剂对波长位置影响，氢键形成，使色氨酸及其衍生物CD谱出现各种多样情况。第67页7.4.1.1.3苯丙氨酸及其衍生物苯丙氨酸及其衍生物近紫外近紫外CD谱谱因为苯环高度对称性，苯丙氨酸侧链CD值和上述两个芳香族氨基酸相比要小得多（见上图）。经典苯丙氨酸模型化合物CD谱在250268nm间显示多个振动能级峰，尤其是268nm谱段，在室温下也能显示陡直峰形。第68页7.4.1.1.4 芳香族氨基酸以及它们芳香族氨基酸以及它们衍生物远紫外衍生物远紫外CD谱谱芳香族氨基酸以及它们衍生物在250nm以下都有较强CD贡献（下列图），在这个区域内，苯丙氨酸CD值和酪氨酸或色氨酸相差不多，这和近紫外区域情况形成对照。在酪氨酸各种模型化合物中，226nm左右CD峰总是正。第69页，N-乙酰酪氨酰胺；-，N-乙酰苯丙氨酸胺；，N-乙酰色氨酰胺第70页7.4.1.1.5 胱氨酸及其衍生物胱氨酸及其衍生物紫外紫外CD谱谱胱氨酸在水溶液中CD谱中，近紫外区负峰归属于二硫键，远紫外区正峰归属于羧基贡献。和其它氨基酸羧基贡献比，此正峰出现在较长波长位置上，这可能是因为羧基和二硫键两个基团电子相互作用，因而降低了羧基跃迁能量；也可能由短波长区域二硫键强负CD峰存在造成。胱氨酸各种衍生物在水溶液中也显示相近CD谱。第71页第72页二硫键是个含有不对称生色基团，其正常双面角靠近90，有右手(P)和左手(M）两种旋转构象，在胱氨酸及其简单衍生物溶液中，二硫键以几乎等量P和M构象存在，因而它们CD贡献相互抵消，即二硫键固有不对称性并不对CD谱作出贡献。胱氨酸及其简单衍生物 CD谱只起源于不对称碳原子对二硫键扰动。胱氨酸以晶体形式存在时，其二硫键只能采取某一个构象。对它晶体所作CD研究显示，波长最长CD谱段可能与二硫键手征性相关，即P构象显示正CD峰，M构象显示负CD峰。第73页7.4.1.1.6 脯氨酸衍生物脯氨酸衍生物CD谱谱核磁共振研究说明，X-Pro酰胺键存在反式一顺式异构现象。Madison和Schelman在对N-乙酸脯氨酸一N，N-二甲基酸胺（AcProDMA）研究中，计算得到了反式与顺式不一样CD谱（见下列图）。在水溶液中，AcProDMA主要以反式异构体存在，在非极性溶剂中主要以顺式异构体存在。上述结果对研究含有较多脯氨酸残基肽CD行为和多聚脯氨酸螺旋构象是很有帮助。第74页第75页第76页7.4.1.1.7 其它氨基酸紫外其它氨基酸紫外CD谱谱在近紫外区，其它氨基酸均无CD贡献。在远紫外区，组氨酸侧链在213nm显示正峰；其余氨基酸普通在200210nm间显示正峰（下列图），此为羧基所贡献，pH值升高使此峰蓝移。第77页第78页7.4.2 用园二色谱研究多肽和蛋白质用园二色谱研究多肽和蛋白质二级结构二级结构7.4.2.1 多聚氨基酸远紫外园二色谱多聚氨基酸远紫外园二色谱利用旋光色散研究蛋白质构象即使有过较大进展，不过存在两个困难。首先是在旋光色散谱中，科顿效应极值都在吸收带极值旁边，而不在吸收带顶端，这对分析科顿效应归属带来了困难。其次是残基本身有旋光值。要讨论ORD与构象关系时，有必要将残基旋光扣除。不过我们只能测出氨基酸旋光值而无法测出残基旋光值，所以这种扣除是很困难。这两个缺点是ORD本身性质所决定。第79页Holzwarth与Doty发表了他们利用圆二色谱来测定多聚氨基酸和肌红蛋白构象工作以后，就逐步有一些工作者从旋光色散转向用圆二色性来研究蛋白质。六十年代初，普通仪器只能测出波长大于250nmCD谱，所以进展不大。以后仪器改进能够测出波长范围在190250nmCD谱。因为这一区域谱线与蛋白质分子主链构象有亲密联络，于是吸引了许多科学家应用CD来研究蛋白质。第80页对应于ORD缺点，CD谱有许多有利方面。首先它峰或放样位置与吸收峰位置基本重合，所以每一个谱峰贡献者是谁能够利用吸收光谱知识来寻找。其次是肽键上与碳原子相关共价键吸收光谱带在红外区，或在低于180nm超远紫外区。在可见波长或紫外区它与碳原子相关价电子不表现出任何吸收带，所以也没有它CD带。这么，残基除非有生色团侧链，不然就不提供CD谱。能够看出ORD缺点在CD谱中就能够防止。第81页多聚氨基酸从化学上讲比蛋白质简单，只含一个或几个氨基酸，所以研究它们构象比较轻易。许多人曾详细地用其它方法（如红外等）研究过它们构象，了解到在何种条件下，它们以哪一个构象存在，所以，蛋白质CD谱能够以多聚氨基酸为模型化合物来着手研究。第82页用许多其它方法证实，多聚-L-赖氨酸（PLL）在pH不一样时有不一样构象。在水溶液中。pH11，室温时，它是螺旋；pH11，52C加热15分钟后即转变成折叠；而在pH5.7时，它是无规卷曲。Greenfield与Fasman利用这一特点测定了PLL在不一样构象状态下CD谱，其结果以下列图。第83页第84页对于螺旋讲，它曲线与PMLG、PLA等相同，也是双负峰。Holzwarth等人证实，谷氨酸、赖氨酸与丙氨酸共聚物在螺旋时也是呈相同曲线。今后Beychok测定多聚氨基酸CD曲线也相同。所以认为，远紫外双负峰是螺旋经典谱形。Gratzer与Cowburn总结了1969年前工作指出，222-223nm间负峰是肽链处于螺旋时肽键n-*跃迁所贡献。不过极值处数值在不一样试验室利用不一样多聚氨基酸，大约有10差异。第85页208-209nm负峰也是螺旋肽键*跃迁所贡献，各家数据能够有25波动。对于191nm讲，它也是螺旋肽键*跃迁贡献，比椭圆值间能够有30波动。实际上，数值间这种差异是不算大，结果相当满意。第86页PLL于折叠时给出曲线是在215nm处负峰。在中性pH时SDS溶液中，PLL也展现折叠。此时它CD谱在218nm有负峰，但218对应变小。许多工作者也发觉，结构CD谱与溶剂有较亲密关系，所以对应地看，折叠椭圆值不如螺旋者那样恒定。不过从谱线形状看，图63曲线2是经典。基于这种种试验基础，普通都认为，该曲线反应了多聚氨基酸折叠结构。第87页无规卷曲时PLL给出曲线是198nm负峰,在220nm附近一个小而平宽正峰。这种峰形是否能经典地代 表 无 规 卷 曲，看 法 有 些 混 乱。Tiffany及 Krimm（1969）发觉Na-PLGA（多聚-L-谷氨酸钠）在水溶液中给出正峰，但在3摩尔升胍中该峰消失，变成了218-220nm处负肩，见下列图。第88页第89页Dearborn与Wetlaufer测定摩尔升胍（PH6.0）中PLLCD谱，发觉它谱形与在0.01摩尔升NaCl中一样，也是无规卷曲状。Fasman等人研究了Na-PLGA和PLL做成干膜时圆二色谱。他们（1970）发觉，在200-205nm有一负峰，同时在215-310nm间有一负肩。另外，Wetlaufer等及Fasman等都发觉，一些变性蛋白质谱形与PLL在溶液中谱形不完全一样。总来看，这些变性蛋白质结果与PLL曲线有两点区分：一是负峰位置不正在198nm，而经常有红移，峰值也小得多。二是220nm附近正小而平宽峰消失，代之以负峰，这些结果以下列图所表示。综观这些曲线，能够认为：200nm附近负峰是无规卷曲特征曲线。第90页第91页6.4.2.2 用蛋白质远紫外圆二色谱用蛋白质远紫外圆二色谱单值法计算单值法计算 螺旋含量螺旋含量 从多聚氨基酸研究得出了肽链在三种构象时经典曲线。从蛋白质CD谱看也有类似曲线。比如，肌红蛋白，胰岛素，溶菌酶等都给出类似于螺旋曲线。免疫球蛋白CD谱类似于多聚氨基酸折叠谱形。所以能够构想不但能够用多聚氨基酸为模型定性地研究蛋白质分子主要包含了什么构象，还可能定量地研究蛋白质分子中各种构象含量。第92页螺旋给出208 nm与222 nm两个负峰。可是当初仪器水平要测准208 nm处是比较困难，所以Fasman等人提出用222来计算蛋白质螺旋度方法。他们假设PLL参考值能够应用于蛋白