DB32_T 3367-2018水稻细菌性条斑病监测与检测技术规程.pdf
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1、ICS 65.020B16备案号:58103-2018DB32江苏省地方标准DB 32/T 33672018水稻细菌性条斑病监测与检测技术规程Technical specification for monitoring and detection for bacterial leaf streak of rice2018-2-10 发布2018-3-10 实施江苏省质量技术监督局发 布DB32/T 33672018I目次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14监测与检测条件.14.1主要试剂.24.2用具及仪器.25监测技术.25.1监测范围.25.2监测方法.26检测技术.
2、36.1样品处理.36.2检测方法.37结果判定和报告.37.1结果判定.47.2结果报告.48样品处理和样品、菌种保存.49疫情处治.4附录 A(资料性附录)试剂及培养基的配制方法.5附录 B(资料性附录)水稻细菌性条斑病基本信息.8附录 C(资料性附录)Padlock 探针结合斑点杂交检测程序.9附录 D(资料性附录)水稻细菌性条斑病疫情监测记录表.11附录 E(规范性附录)植物有害生物样本鉴定报告.12DB32/T 33672018II前言本标准按GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分:标准的结构及编写给出的规则起草。本标准由江苏省农业科学院提出。本标准起草单位:江苏省农业科
3、学院。本标准主要起草人:刘凤权、赵延存、徐会永、赵杨扬、龚伟荣、田子华。DB32/T 336720181水稻细菌性条斑病监测与检测技术规程1范围本标准规定了水稻细菌性条斑病的监测与检测技术方法。本标准适用于水稻细菌性条斑病发生区及杂交水稻制种区。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 3543.2-1995农作物种子检验规程 扦样GB 8371-2009水稻种子产地检疫规程GB/T 28078-2011水稻白叶枯病菌、水稻细菌性条斑病菌检疫鉴定方法NY/
4、T 2287-2012水稻细菌性条斑病菌检疫检测与鉴定方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1检疫性有害生物 quarantine pest对受其威胁的地区具有潜在的经济重要性,但未在该地区发生,或虽已发生但分布不广并进行官方防治的有害生物。3.2疫区 epidemic area由官方划定已发现有检疫性有害生物危害并由官方控制的地区。3.3监测 surveillance对某种疫病的发生、流行、分布及相关因素进行系统的长时间的调查与检测,以掌握该疫病的发生发展趋势。3.4检测 test为确定是否存在有害生物或为鉴定有害生物种类而进行的,除目测以外的检查。4监测与检测条件DB32/T 3
5、367201824.1主要试剂磷酸氢二钠(Na2HPO4)、磷酸二氢钾(KH2PO4)、碘化钾(KI)、碘(I2)、氯化钾(KCl)、氢氧化钠(NaOH)、碳酸氢二钠(Na2HCO3)、氯化钠(NaCl)、叠氮化钠(NaN3)、氯化镁(MgCl2)、七水硫酸镁(MgSO47H2O)、对硝基苯磷酸二钠(PNPP)、草酸铵(NH4)2C2O4、顺丁烯二酸(C4H4O4)、十二烷基硫酸钠(SDS)、柠檬酸三钠、吐温-20、Tris碱、Tris-HCl、硼酸、结晶紫、番红、EDTA、无水乙醇、琼脂糖、DIG DNA Labeling Kit(Roche)、市售抗体、市售酶标抗体、脱脂奶粉、PCR试剂。
6、监测和检测过程中所需溶液及培养基配方,参见附录A。除另有规定外,所用试剂均为分析纯或生化试剂。4.2用具及仪器采集夹、采集袋、标本夹、标本纸、剪刀、纸袋、放大镜、镊子、刀片、标签纸、超净工作台、高压灭菌锅、培养箱、显微镜、低温冷冻高速离心机、酶标仪、电泳仪、常规PCR仪、凝胶成像系统、超纯水仪、移液器、GPS等。5监测技术5.1监测范围重点监测杂交水稻制种基地、病害发生区、水稻种子调运过程。5.2监测方法5.2.1种子监测5.2.1.1调运种子的监测对调运种子,特别是从疫情发生区调往非疫区的杂交水稻种子,查阅调运种子的品种、产地、发病史、检疫等信息,按照GB/T 3543.2-1995中5的要
7、求进行抽样,对疑似带菌种子进行室内检测。5.2.1.2市场销售种子的监测对市场销售种子,特别是疫区市场销售种子,查阅种子生产流通信息及品种发病历史等信息,观察种子的外观,按照GB/T 3543.2-1995中5的要求进行抽样,将样品进行室内检测。5.2.2田间监测5.2.2.1杂交水稻制种基地田间监测秧田期踏查1次,拔节至抽穗期至少踏查2次,乳熟期踏查一次,特别是在台风暴雨前后要及时进行踏查。每个品种均要踏查,踏查面积占总面积的50%以上,踏查方法参照GB 8371-2009中8.1的要求执行。调查过程中,发现具有水稻细菌性条斑病典型症状(见附录B),即可认定为水稻细菌性条斑病;对疑似症状的叶
8、片,直接采样进行室内检验。5.2.2.2疫区田间监测根据种植地发病史和栽培品种发病史,选择有代表性的田块进行定期踏查。秧田期踏查1次,拔节至抽穗期至少踏查2次,特别是在台风暴雨前后要及时进行踏查。发现初始发病点后,要对该发明点附近田块和该区域(以县、区为单位)内感病品种进行普查。在调查过程中,发现具有水稻细菌性条斑病典型症状(见附录B),即可判定为水稻细菌性条斑病;对疑似症状的叶片,直接采样进行室内检验。DB32/T 3367201835.2.2.3非疫区田间监测选择区域内具有代表性的杂交水稻田块,秧田期踏查1次,拔节至抽穗期踏查2次。在调查过程中,发现具有水稻细菌性条斑病疑似症状叶片(见附录
9、B),直接采样进行室内检验。对疑似发病地点周边田块和该区域(以县、区为单位)内种植该品种田块进行踏查,踏查面积占总面积的30%以上。6检测技术6.1样品处理6.1.1种子样品处理水稻种子样品的处理参照GB/T 28078-2011中8.1的要求执行。6.1.2叶片样品处理水稻叶片样品的处理参照GB/T 28078-2011中8.2的要求执行。6.2检测方法6.2.1常规检测6.2.1.1菌溢检查切取田间采回的植株叶片病健交界处约20 mm2,平放在载玻片的水滴中,加盖玻片后,在低倍显微镜下观察并记录有无喷菌现象。6.2.1.2形态特征检测将样品提取液分别划线于NA和NBY培养基上,28培养2
10、d3 d,参照附录B.3的标准执行。6.2.1.3革兰氏染色检测按照NY/T 2287-2012中7.2.3的要求执行。6.2.1.4致病性测定参照GB/T 28078-2011中12的要求执行。6.2.2Padlock 探针结合斑点杂交检测水稻细菌性条斑病Padlock探针结合斑点杂交检测程序参见附录C。6.2.3PCR 检测参照NY/T 2287-2012中7.4的要求执行。6.2.4ELISA 检测参照GB/T 2287-2012中7.3的要求执行。如采用市售的试剂盒,按说明操作。7结果判定和报告DB32/T 3367201847.1结果判定7.1.1症状识别判定田间植株发病症状符合附录
11、B描述的水稻细菌性条斑病典型症状,判定为水稻细菌性条斑病。7.1.2常规检测结果判定镜检有菌溢现象,分离培养物形态特征和培养特性符合水稻细菌性条斑病菌的形态特征(参见附录B),革兰氏染色阴性,致病性测定产生典型症状,并再次从接种病斑成功分离病原菌,确定病原菌为水稻细菌性条斑病菌。7.1.3Padlock 探针结合斑点杂交检测结果判定观察斑点杂交尼龙膜显色结果,阳性对照显色,且阴性对照不显色的前提下,待测样品显色,即可判定样品携带水稻细菌性条斑病菌;否则为阴性反应,即样品不携带水稻细菌性条斑病菌。7.1.4PCR 检测结果判定观察电泳结果,阳性对照在338 bp处有条带出现,且阴性对照无条带出现
12、的前提下,待测样品在338bp处有条带出现,即可判定样品携带水稻细菌性条斑病菌;否则为阴性反应,即样品不携带水稻细菌性条斑病菌。7.1.5ELISA 检测结果判定在阴性对照OD值0.1,且阳性对照OD值大于阴性对照OD值2倍的前提下,样品孔OD值大于阴性对照OD值2倍时,判定为阳性反应,即样品携带水稻细菌性条斑病菌;否则判定为阴性反应,即样品不携带水稻细菌性条斑病菌。7.2结果报告7.2.1监测报告记录监测结果并填写疫情监测记录表(见附录D)。对监测结果进行整理汇总,形成监测报告。7.2.2鉴定报告将实验室检测鉴定结果填入植物有害生物样本鉴定报告(见附录E)。8样品处理和样品、菌种保存监测与检
13、测过程中使用的有关材料和用具,在使用完毕后应进行消毒和除害处理。经检测鉴定后的种子样品应在4 下保存三个月;保存期满后,进行灭活处理。分离鉴定的水稻细菌性条斑病菌利用25%甘油保存于-80。9疫情处治经监测或室内检测发现水稻细菌性条斑病,应指导生产、销售和个人实施检疫处治及病害防治。DB32/T 336720185AA附录A(资料性附录)试剂及培养基的配制方法A.1革兰氏染色液A.1.1结晶紫液A液:结晶紫 2 g,95%乙醇 20 mL;B液:(NH4)2C2O40.8 g,蒸馏水80 mL。使用前将A、B液相混,静置48 h后使用。A.1.2碘液I21 g,KI 2 g,蒸馏水 300 m
14、L,将KI溶于少量蒸馏水中,然后加入I2,待I2全部溶解后,加水稀释至300 mL。A.1.3番红花红液2.5%番红花红乙醇溶液10 mL,蒸馏水100 mL。A.2样品提取液取1.15 g Na2HPO4、0.2 g KCl、0.2 g KH2PO4、8 g NaCl、0.2 g NaN3,用1 000 mL蒸馏水溶解,并调整pH值到7.4。A.3Padlock探针结合斑点杂交检测A.3.1中和缓冲液取87.66 g NaCl、78.8 g Tris-HCl,用蒸馏水溶解并定容至1 000 mL,并调整pH值到7.2。A.3.2碱性转移液取16 g NaOH、58.44 g NaCl,用蒸馏
15、水溶解并定容至1 000 mL。A.3.3Maleic acid Buffer取11.61 g 顺丁烯二酸、8.77 g NaCl,用蒸馏水溶解并定容至1 000 mL,并调整pH值到7.5。A.3.4Detection Buffer取15.76 g Tris-HCl、5.84 g NaCl,用蒸馏水溶解并定容至1 000 mL,调整pH值到9.5,然后121湿热灭菌20 min。A.3.520SSC取175.32 g NaCl、88.23 g 柠檬酸三钠,用蒸馏水溶解并定容至1 000 mL,调整pH值到7.0,然后121湿热灭菌20 min。DB32/T 336720186A.3.6预杂交
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