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纤维素酶的检测方法
摘要：本文主要介绍了纤维素酶的降解原理，通过实验比较了四种常用纤维素酶的检测方法的稳定性，以及纤维素酶的发展前景，为纤维素酶的应用提供了进一步的参考价值。
关键词：纤维素酶 酶活测定 葡萄糖 回归方程
一、纤维素酶及其降解原理
纤维素是高等植物细胞壁的主要成分，占植物总干重的30%-50%，是地球上分布最广，含量最丰富的可再生性碳源化合物，占地球总生物量的40%。据报道，我国每年光作物秸秆，稻梗等含纤维素较丰富的物质就有5亿吨之多，全球每年通过光合作用产生的植物物质高达1.55X109吨，其中尚有89%未被人们利用，而大量的秸秆，稻梗等含纤维素丰富的物质的利用率也很低。大多采用燃烧的方式来处理，这样就造成了环境污染，破坏了土壤的理化性质和丧失了有机质成分。所以，纤维素的充分利用与有效的转化对于解决当前的能源危机，粮食短缺，环境污染等有重大意义。
纤维素酶是分解纤维素的一类酶，它能将纤维素分解为葡萄糖，充分的利用了纤维素。自1906年Sellieres 在蜗牛消化液中发现纤维素酶以来，纤维素酶的研究和应用受到了国内外学者的极大关注，取得了很大进展。目前，国内外学者通过筛选产酶菌株来发酵产酶，再应用纤维素酶到食品，医药，饲料，洗涤等工业中，不仅解决了纤维素的再利用问题还取得了很可观的经济效益。
纤维素酶是由许多具有高协同作用的水解酶组成的。习惯上将纤维素酶分成三种主要成分：内切酶（内切β-1,4-葡萄糖酶，也称Cx酶）、外切酶（外切β-1,4葡萄糖酶，也称C1酶）、β-1,4葡萄糖酶（即为纤维二糖酶）[1]。C1酶主要作用于天然纤维素，使之转变为非结晶的纤维素。Cx酶又分为Cx1酶和Cx2酶。Cx1酶是一种内断型纤维素酶，它从水合非结晶纤维素分子内部作用于β-（1,4）糖苷键，生成纤维糊精和纤维二塘。Cx2酶是一种外断型纤维素酶，它从水合性纤维素分子的非还原端作用于β-（1,4）糖背键，逐步切断β-（1,4）糖节键生成葡萄糖。纤维二糖酶则作用于纤维二糖，生成葡萄糖。
纤维素酶在降解纤维素过程中的作用机理至今还不是很清楚。目前关于Cx酶、C1酶和β-1,4葡萄糖酶这3种酶的作用机理的假说比较公认的是以下3种，其中协同理论最为广泛接受。
（1）C1-Cx假说。该理论认为首先由C1酶作用于纤维素酶的结晶区，再由外切酶和β-葡萄糖苷酶联合作用产生二糖和葡萄糖。其水解模式如图1所示。

图1 C1-Cx假说示意
（2）顺序作用假说。该假说认为首先由内切酶随机的作用于纤维素的葡萄糖苷键，打开缺口，然后由外切酶在新生键末端切下一个纤维二糖，再由β-葡萄糖苷酶将它水解成葡萄糖。
（3）协同作用假说。该理论认为是内切葡萄糖酶首先进攻纤维素的非结晶区，形成外切纤维素酶需要的新的游离末端，然后外切纤维素酶从多糖链的非还原端切下纤维二糖单位，β-葡萄糖苷酶再水解纤维二糖单位形成葡萄糖。
二、纤维素酶的检测方法
纤维素酶各组分的底物专一性不同，而且纤维素酶是多组分复合物。纤维素酶作用的底物也比较复杂，同时不同来源的纤维素酶其组成及各组分的比例有较大的差异，致使纤维素酶活力的测定方法复杂而不统一。
其中主要的检测方法有：棉线切断法， 滤纸崩溃法，羧甲基纤维素钠为底物的粘度减少和还原糖增加的测定法[2]，分光光度计法[3]，快速测定纤维素酶CMC液化活力法[4]，平板法，巴鲁阿-斯温( Bamch and swain) 测定法[5]。
对于细菌等对纤维素分解能力强的微生物，由于对其酶的形成、分泌和作用机制研究较少，这些测定方法不一定适用。但目前对于这些方法测定的具体数值的可信度、可比性，却没有相关的报道研究。下面主要通过四种方法进行实验，研究这些实验方法的稳定性，从而为实验研究提供一定的参考依据[6]。
2.1、材料与方法
材料：主要仪器HH-6型恒温水浴锅；22PC型分光光度计；HG1001型电热鼓风干燥箱；FA2004型电子分析天平；UV-2401型紫外双光束分光光度计
实验方法：
2.1.1 试剂的配置：（1）PH4.6醋酸-醋酸钠缓冲液：11.8ml 冰醋酸定容至100ml，称取27,2g的醋酸钠溶解并定容至100ml将上述两种溶液等体积混合。
（2）3,5-二硝基水杨酸溶液（DNS）：称取3,5-二硝基水杨酸6.3g于500ml大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后加入2mol/ml NaOH溶液262ml，再加入到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g无水亚硫酸钠搅拌溶解，冷却后移入1000ml容量瓶中， 用蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。

（3）CMC-Na溶液：称取0.625g 羧甲基纤维素钠，加热溶解，定容至100ml[7]。
2.1.2 酶活测定方法
葡萄糖标准曲线的绘制
原理：3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的强度成比例关系，利用分光光度计测出其在520nm处的吸光度，得出还原糖的量。
葡萄糖标准溶液的配制：将葡萄糖放在110℃烘箱中烘2h至恒重，称取0.1080g烘好的葡糖糖，溶解并定容至100ml。
取16支具塞试管，依次编号为0,1,2,3,4,5,6,7并作平行实验。由于各种方法反应体系的总体积不同，所以需作不同的标准曲线，所加的量也有所不同。
现以总体积为9ml体系为例：
表1葡萄糖标准曲线绘制方法
管号
0
1
2
3
4
5
6
7
葡萄糖量（ml）
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
蒸馏水（ml）
7
6.5
6
5.5
5
4.5
4
3.5
DNS(ml)
2
2
2
2
2
2
2
2
摇匀后置于沸水浴中加热5min后，冷却定容至25ml。摇匀后以0号管为对照于最大吸收波长处测定OD值，以葡萄糖含量μmol为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。
酶活测定方法的比较
配制不同浓度的标准酶液：用去离子水100ml来溶解100mg纤维素酶（≥1000IU），配制成1mg/ml酶液。测定时分别吸取0.1ml，0.2ml，0.3ml，0.4ml，0.5ml，0.6ml上述酶液用水补足至1ml即为不同浓度的酶液。
（1）滤纸酶活（FPA）测定方法
滤纸是聚合度和结晶度都居“中等”的纤维性材料，以其为底物经纤维素酶水解后生成还原糖的量来表征纤维素酶系总的糖化能力的方法，此方法应用广泛，它反映了三类酶组分的协同作用，统称滤纸酶活（Filter Paper Activity，FPA）
方法：取1ml酶液加1ml 0.1mol/L、Ph4.6的醋酸缓冲液，预热到50℃，加入1条1x6cm新华滤纸（50

±1mg），50℃保温1h。取出，沸水浴灭活5min，冷却至室温，用3ml DNS试剂显色后稀释3倍，测OD值（520nm）。OD值越大，说明该菌株的酶活力越强[8]。
酶活力计算：从标准曲线中查出葡萄糖μmol数；

其中：60为保温时间（酶与底物作用时间，min）；Ew为粗酶液的体积（ml）；
μ是指在特定条件下，每分钟催化纤维素水解成1μmol葡萄糖的酶量。
（2）羧甲基纤维素钠盐（CMC-Na）酶活性测定方法
原理：纤维素酶对CMC-Na有降解能力，生成葡萄糖等还原糖，再用DNS法显色，用标准葡萄糖溶液作标准液，22PC分光光度计在520nm处测其吸光度，以每分钟生成相当于1μmol的葡萄糖为一个酶活性单位。
取3支带有20ml刻度的试管，1支管作空白对照，2支管作平行样品管。每支样品管中加1ml酶溶液，置于50℃水浴锅中预热2min，然后在3支试管中分别加入4ml已预热至50℃的底物溶液，准确计时5min取出，每管立即分别加入1ml 2mol/L氢氧化钠溶液和2ml DNS显色液，摇匀后在对照管中再加入1ml 酶液。将3支试管放入沸水浴中，5min后立即取出，流水冷却，用蒸馏水定容至20ml，于520nm处测OD值。
酶活力计算：从标准曲线中查出葡萄糖μmol数；

其中：5为保温时间（酶与底物作用时间，min）；Ew为粗酶液的体积（ml）；μ是指在特定条件下，每分钟催化纤维素水解成1μmol葡萄糖的酶量。
（3）染色纤维素测定方法[9]
用考马斯亮蓝使滤纸染色酶解后在最大吸收波长处测释放的着色物的吸光值，代表酶活，以吸光度为纵坐标，酶浓度为横坐标做曲线。
在实际测定时，先利用紫外双光束分光光度计进行波长扫描，发现其在536nm 处吸收峰最高，因此在实验时以此波长作为测定波长。
（4）CMC粘度降低测定方法
底物溶液9ml，加酶液1ml，40℃，测定底物粘度减至一半时所需时间，以奥氏粘度计测定。以10min能使底物粘度降低一半的酶活作为一个单位。
2.2结果与分析
葡萄糖标准曲线绘制

实验中所用的标准葡萄糖曲线绘制结果如下：由于在以后的测定中，各方法的反应体系并不相同，所以每个体系须有各自的葡糖糖标准曲线作为今后的参照。CMC糖化力测定参照图1，有三条曲线，是因为在常用测定中酶与底物不同，而造成它们各自体系的溶液的总体积也不相同，因此此方法的葡萄糖标准曲线有三条。滤纸法参照图2。

图1 CMC酶活测定法葡糖糖标准曲线(不同体系)
所得三条曲线的回归方程如下：
y1=0.0292x-0.0101
R12=0.9981
y2=0.0211x-0.0107
R22=0.9965
y3=0.0163x-0.0074
R32=0.9955

图2 滤纸法葡糖糖标准曲线
所得曲线的回归方程：
y=0.1418x-0.0141

R2=0.998
标准纤维素酶酶活曲线
酶活测定方法结果比较如下：
表2 标准纤维素的CMC酶活力和滤纸酶活力测定结果

CMC酶活力测定法
滤纸酶活力测定法（FPA）
含酶量（mg/mL）
OD值
查得葡萄糖量（μmol）
酶活（U/mL）
OD值
查得葡萄糖量（μmol）
酶活（U/mL）
0
0
0
0
0
0
0
0.2
0.102
3.84
0.768
0.054
0.480
0.008
0.3
0.146
5.35
1.069
0.090
0.734
0.012
0.4
0.202
7.26
1.453
0.115
0.910
0.015
0.5
0.258
9.18
1.836
0.148
1.144
0.019
0.6
0.296
10.48
2.097
0.182
1.380
0.023

所得曲线的回归方程:
y=3.5908x R2=0.9973
y=0.0383x R2=0.9985

实验结果表明：用标准纤维素酶所做的CMC酶活测定和滤纸酶活测定，从回归曲线可以看出他们的线性较好，可以充分说明这2种方法比较稳定。而且CMC酶活测定法和滤纸酶活测定法在很多报道中均在采用，这样使实际实验的结果更具可比性。
所得曲线的回归方程：
y=0.728x-0.029
R2=0.8828
所得曲线的回归方程：
y=0.0316x-0.0007
R2=0.979
由上述结果可知：CMC粘度降低法的线性没有滤纸酶活测定法和CMC酶活测定法来得好，而且在实验过程中，两个平行实验之间有较大的误差。但从回归方程就能看出，该方法的稳定性较其他3种方法有很大的偏差。
表3 标准纤维素的CMC粘度降低法和染色纤维素法测定结果

CMC粘度降低法
染色纤维素法
含酶量（mg/mL）
所用时间（min）
酶活（U/mL）
OD值
酶量（mg）
0
0
0
0
0
0.2
77.4
0.129
0.0048
0.2
0.3
60.6
0.165
0.0093
0.3
0.4
45.3
0.221
0.0107
0.4
0.5
37.5
0.267
0.0144
0.5
0.6
20.0
0.500
0.0195
0.6

2.3结论
本次实验研究了纤维素酶测定方法中常用的4种方法，即：FPA测定法、CMC-Na酶活性测定法、染色纤维素测定法以及CMC粘度降低测定法，比较了这4种方法测定的线性相关性以及稳定性，经过实验研究表明，FPA测定法和CMC-Na 酶活性测定法较稳定，线性相关性较高，可以作为研究测定的可靠方法。
三、纤维素酶的应用与发展趋势
纤维素酶可广泛用于食品、纺织、饲料、酿酒、石油勘探、中药成分提取等众多领域，特别是在纺织、洗涤、造纸、和生物能源等工业应用上具有重要地位。
自20世纪90年代开始，酸性纤维素酶用于牛仔布的水洗整理(biostoning and biofinishing)，从而开始了纤维素酶在工业上的大规模应用，这也是目前纤维素酶应用最成功、用量最大的领域。在牛仔布的水洗整理上酸性纤维素酶具有用量少、效果快的特点，但服装返染严重；中性纤维素酶反应条件温和而且不易返染，织物档次得到提高，已普遍代替酸性酶。但在棉织物的整理上，如去球(depilling)脱毛( reduced fuzz)以及增柔(softness)等，酸性纤维素酶特别是木霉产生的纤维素酶仍具有更多的优势。利用纤维素酶对棉织物的整理并不需要纤维素酶的所有组分，如进行棉织物的脱毛、去球等整理，仅有内切酶就可产生明显的效果，但是棉织物的减量也较严重，影响了织物的强度，通过基因工程改变内切酶和外切酶的比例，可以在一定程度上解决这个问题。
纤维素酶用于造纸工业，是利用外切纤维素酶只从末端切断纤维素的作用原理，提高纸张的光洁度。碱性纤维素酶用于洗涤剂工业，可以提高棉织物的洗净度，起主要作用的是内切酶(CMC酶)，是近些年来洗涤剂工业竞相开发的新酶种之一。这两种工业应用涉及的纤维素酶只需要纤维素酶系中的单一组分，基因工程技术可以在其中得到广泛的应用。

纤维素酶将来最大的用途，或者可以使其产量得到巨大增长的工业需求将是纤维素乙醇的开发。自上世纪70年代石油危机以来，世界各国都致力于开发新的可再生能源，而生物乙醇(bioeth-anol)是被普遍看好的新型燃料。进入21世纪，利用纤维素酶转化纤维素物质产生葡萄糖进而发酵获得生物乙醇，可以避免对粮食作物的大量损耗，引起了各国政府和研究机构的重视，这其中的关键是纤维素酶的成本问题。由于纤维素酶发酵活力较低，因此其应用成本也较高。同时纤维素酶相比其他糖苷水解酶类，比活力至少要低1~2个数量级，如滤纸酶的比活力为1 IU/mg左右，CMC的比活力约为10 IU/mg，从而造成酶的作用效率较低。这是两个限制纤维素酶应用的瓶颈问题，也是纤维素酶研究的热点与难点。目前通过传统的菌种诱变和基因工程技术可以较大幅度地提高目的蛋白的表达量，从而提高酶的发酵水平，如诺维信公司与美国能源部合作，将制造纤维素乙醇中的酶制剂成本由2001年的每加仑5美元降低到2004年的30美分，2005年又降低到每加仑18美分。还可以通过改善发酵条件和工艺，如采用固体发酵来大幅度降低发酵成本。但是提高酶降解天然纤维素的效率则需要，深入研究纤维素酶的结构与功能以及作用方式，进而对其进行有效改造;或者通过筛选新的产酶菌种，发现具有开发潜力的新酶源。
总之，纤维素酶是目前糖苷酶类中惟一尚有大量亟待解决问题的酶，也是有着巨大工业和市场潜力的酶。进一步阐明纤维素酶的结构与功能，研究纤维素酶的基因表达与调控的关系；针对不同工业需要研制不同组分比例的纤维素酶；提高纤维素酶水解天然纤维素的比活力；开发适应不同温度(低温或高温纤维素酶)的纤维素酶是当前纤维素酶的主要研究趋势。
参考文献
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