YY_T 0870.6-2019 医疗器械遗传毒性试验 第6部分:体外哺乳动物细胞微核试验.pdf
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1、书 书 书犐 犆犛 犆 中华人民共和国医药行业标准犢犢犜 医疗器械遗传毒性试验第部分:体外哺乳动物细胞微核试验犜 犲 狊 狋犳 狅 狉犵 犲 狀 狅 狋 狅 狓 犻 犮 犻 狋 狔狅 犳犿犲 犱 犻 犮 犪 犾犱 犲 狏 犻 犮 犲 狊犘 犪 狉 狋:犐 狀狏 犻 狋 狉 狅犿犪犿犿犪 犾 犻 犪 狀犮 犲 犾 犾犿 犻 犮 狉 狅 狀 狌 犮 犾 犲 狌 狊狋 犲 狊 狋 发布 实施国家药品监督管理局发 布书 书 书前言 医疗器械遗传毒性试验由以下部分组成:第部分:细菌回复突变试验;第部分:体外哺乳动物细胞染色体畸变试验;第部分:用小鼠淋巴瘤细胞进行的基因突变试验;第部分:哺乳动物骨髓红细胞
2、微核试验;第部分:哺乳动物骨髓染色体畸变试验;第部分:体外哺乳动物细胞微核试验。本部分为 的第部分。本部分按照 给出的规则起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。本部分由国家药品监督管理局提出。本部分由全国医疗器械生物学评价标准化技术委员会()归口。本部分起草单位:山东省医疗器械产品质量检验中心、深圳市药品检验研究院(深圳市医疗器械检测中心)。本部分主要起草人:王鸾鸾、王昕、曹苹、王晓炜、林钟石。犢犢犜 引言 中给出的检测潜在遗传毒性物质的试验方法均为经济合作与发展组织()化学品测试指南中规定的方法,但这些方法是针对化学品的特性制定而成,同时未给出详
3、细的试验步骤,因此不适宜直接用于医疗器械材料的检测。参照试验方法基本原则,并根据医疗器械材料的特性对试验方法进行了适当的修改,规定了详细的试验步骤,可作为 中遗传毒性试验的补充方法标准。的本部分参照 ()方法,在有或无代谢活化系统的情况下,在培养细胞与医疗器械材料接触时使用细胞胞质分裂阻断剂(如细胞松弛素)进行处理,通过对存在双核细胞的哺乳动物细胞的微核情况进行分析,评价试验样品潜在的致畸变性。的本部分的目的是为了筛选医疗器械材料中具有导致哺乳动物细胞胞质形成微核潜能的物质。微核可来源于无着丝粒的染色体片段或在细胞有丝分裂后期不能迁往细胞两极的整条染色体。该试验用于检测在细胞暴露于受试物期间或
4、暴露后,受试物对经历过分裂的细胞诱发断裂和非整倍体作用的活性。本部分需要使用外源性代谢活化系统。但是,这种外源性系统不能完全模拟哺乳动物的体内情况。避免由、渗透压的改变或高水平细胞毒性可能导致的假阳性结果。的本部分选用已建立的细胞系、人类或啮齿动物来源的原代细胞。根据培养能力、核型稳定性(包括染色体数目)和微核背景频率选择试验用的细胞。目前,虽然现有的数据无法提出确切的建议,但在评估化学危险时,考虑到 状态、遗传(核型)稳定性、修复能力和来源(啮齿动物与人类)的选择是很重要的。因此,本部分的使用者可考虑这些和其他细胞特性对检测微核的细胞系性能的影响。犢犢犜 医疗器械遗传毒性试验第部分:体外哺乳
5、动物细胞微核试验范围 的本部分规定了医疗器械材料体外哺乳动物细胞微核试验方法。本部分适用于通过测定医疗器械材料产生的体外哺乳动物细胞微核数目,筛选医疗器械材料是否具有潜在遗传毒性作用。注:纳米材料的相关试验可参照本部分进行。规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。医疗器械生物学评价第部分:风险管理过程中的评价与试验 医疗器械生物学评价第部分:遗传毒性、致癌性和生殖毒性试验 医疗器械生物学评价第 部分:样品制备与参照材料术语和定义 、和 界定的以及下列术语和定义适用于
6、本文件。非整倍体剂犪 狀 犲 狌 犵 犲 狀通过与细胞有丝分裂和减数分裂周期相关的成分互相作用,引起细胞或生物体非整倍染色体形成的任何物质。非整倍体犪 狀 犲 狌 狆 犾 狅 犻 犱 狔正常二倍体(或单倍体)染色体数目中缺少或增加一条或多条,但不是整套染色体(多倍体)的增减。细胞增殖犮 犲 犾 犾狆 狉 狅 犾 犻 犳 犲 狉 犪 狋 犻 狅 狀作为细胞有丝分裂的结果,细胞的数量增加。着丝粒犮 犲 狀 狋 狉 狅犿犲 狉 犲一条染色体内的两条染色单体连接在一起的区域。断裂剂犮 犾 犪 狊 狋 狅 犵 犲 狀任何能引起细胞群或真核生物染色体结构畸变的物质。胞质分裂犮 狔 狋 狅 犽 犻 狀 犲
7、狊 犻 狊细胞核在有丝分裂后形成两个子细胞的胞浆分离过程,并且每个子细胞都有一个细胞核。犢犢犜 胞质分裂阻断增殖指数犮 狔 狋 狅 犽 犻 狀 犲 狊 犻 狊 犫 犾 狅 犮 犽狆 狉 狅 犾 犻 犳 犲 狉 犪 狋 犻 狅 狀犻 狀 犱 犲 狓;犆犅犘 犐胞质分裂阻断剂处理组的细胞群的激发分裂细胞数与未处理的细胞群对照的比值。细胞阻滞犮 狔 狋 狅 狊 狋 犪 狊 犻 狊细胞生长增殖抑制。细胞毒性犮 狔 狋 狅 狋 狅 狓 犻 犮 犻 狋 狔在使用细胞松弛素()时,与阴性对照相比 或 的减少数。微核犿 犻 犮 狉 狅 狀 狌 犮 犾 犲 犻从细胞主核分离并独立于细胞主核的小核,由在细胞有丝分
8、裂或减数分裂末期遗留在胞质内的染色体片段或整条染色体形成。狆 状态狆 狊 狋 犪 狋 狌 狊 蛋白质参与细胞周期调控、细胞凋亡和修复。在缺乏功能性 蛋白质的细胞中,当损伤时,不能通过抑制细胞周期或不能通过凋亡或其他机制(例如诱导修复)消除损伤的细胞,理论上更容易发生基因突变或染色体畸变。复制指数狉 犲 狆 犾 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀犻 狀 犱 犲 狓;犚 犐在暴露期和恢复时处理组完成的细胞分裂与未处理的对照相比所占的比率。主要设备超净工作台、培养箱、恒温水浴箱、倒置显微镜、光学显微镜、压力蒸汽灭菌器等。活化系统、培养液和试剂常用的试验用活化系统为 混合液,和 混合液的制备参见附录的规定或购
9、买市售商品。培养液和试剂参见附录的规定制备或购买市售商品。胞质分裂阻断剂()购买市售商品。注:在细胞的处理过程中避免使用会降低分裂指数的试剂,尤其是一些钙络合剂。注:的适合浓度一般为 。实验室测定每种细胞类型使用的 合适浓度,以保证在溶剂载体对照组中获得理想的双核细胞数。当受试物用流式细胞术评价微核时,是不适用的。细胞系可选用的细胞系为中国仓鼠肺细胞()、中国仓鼠卵巢细胞()、中国仓鼠肺细胞()、小鼠淋巴瘤细胞()或人细胞系如等。宜使用合适的培养液和培养条件(培养容器、湿化的,培养温度)来维持所培养细胞的生长。宜定期检查细胞系染色体数目的稳定性和支原体污染情况。注:对 可能具有潜在的细胞毒性,
10、在使用此细胞时不推荐使用 。使用其他细胞株和细胞类型宜根据本标准规定可接受的条件说明其合理性。注:当使用原代细胞时,在可行的情况下考虑使用来自人类的原代细胞,并根据人类伦理原则和规定进行抽样。犢犢犜 人外周血淋巴细胞宜来自年轻(约 岁 岁)、无吸烟史、无已知疾病且最近未接触遗传毒性物质(如化学试剂、电离辐射)的献血者;如果从一个以上的供血者获得的细胞混合使用时说明献血者的数量;女性的微核频率随着年龄增加而增加的现象要比男性更为明显,因此注意选择混合使用的献血者。注:由于不同细胞周期对试验样品的敏感程度未知,将细胞培养物保持在对数细胞生长期(细胞系)或刺激分化(淋巴细胞的原代培养物),以使其在细
11、胞周期的不同阶段暴露于试验样品。需要用有丝分裂剂刺激分裂时,通常不再使用同步化的原代细胞(例如有丝分裂刺激 的人淋巴细胞),但只要证据合理也可以接受。试验前准备 器具灭菌与试验样品和对照品接触的所有器具应采用可靠方法灭菌,置压力蒸汽灭菌器内 ,或置电热干燥箱内 。试验环境要求试验应在无菌操作台或超净工作台中进行。样品制备宜根据 的原则制备试验液。可采用 氯化钠注射液(或细胞培养液)和或其他适宜溶剂作为浸提介质。浸提介质不应影响试验的进行,例如改变细胞生长,影响试验样品的完整性,与培养容器反应,破坏代谢活化系统等。如怀疑试验样品可能对本试验细胞系产生毒性作用时,应进行预试验来确定适宜的试验液浓度
12、。注:附录中针对不同的医疗器械提供了,三种样品制备方法,可参考使用。注:若采用浸提液进行试验,考虑采用单剂量组试验(即试验样品原液或 的浸提原液)时,对试验所采用的剂量范围提供相应的支持性数据。注:如选用 氯化钠注射液作为浸提介质,最终接触时浓度宜不大于(体积分数);高浓度的有机溶剂具有细胞毒性作用。因此,如采用有机溶剂为浸提介质,最终接触时浓度宜不大于(体积分数);在使用溶解 时,作为浸提介质的有机溶剂与溶解 的有机溶剂的总体积不大于(体积分数)。如选用含血清细胞培养液作为浸提介质,最终接触时浓度宜为 (体积分数)。若使用没有充分确认的溶剂(如乙醇或丙酮),提供相应的数据支持资料来表明它们与
13、试验样品和测试系统之间的相容性并排除溶剂自身的遗传毒性。在缺乏支持数据的情况下,推荐使用未处理对照,以证明所选择溶剂的适宜性。注:可降解吸收产品的样品制备时考虑产品的溶解度、和渗透压对试验体系的影响。对照样品制备 阴性对照阴性对照选用同批号试验样品浸提介质,不加试验样品并在同条件下制备。阳性对照阳性对照用以证明实验室在所用测试方案的条件下鉴定染色体断裂剂、非整倍体剂能力以及测试外源性代谢活化系统的有效性(如适用)。阳性对照物举例见表,如有充分理由时也可采用其他适宜的阳性对照物。如果在有和无活化系统的短期接触试验中采用一种断裂剂作为唯一的阳性对照时,在长期接触组宜采用一种非整倍体剂作为阳性对照。
14、犢犢犜 表阳性对照物举例特征化学物化学物质登记号无外源性代谢活化系统阿糖胞苷 丝裂霉素 甲磺酸甲酯 硝基喹啉 氧化物 有外源性代谢活化系统苯并()芘 环磷酰胺 非整倍体剂秋水仙碱 长春碱 未处理对照如不能证实所用浸提介质不具有致突变性,还需设未处理对照。试验步骤 预实验对怀疑有细胞毒性反应的试验样品应进行预实验。宜避免最高浓度的试验样品或浸提液产生的假阳性反应,如产生过度的细胞毒性、在细胞培养液中出现沉淀或和渗透压发生显著变化。如果试验样品使培养液的随时间发生明显的变化,则可以调节最终处理培养液的,以避免产生假阳性结果并保持适宜的培养条件。宜在有或无代谢活化的情况下,使用适当的细胞死亡和生长的
15、指标来确定细胞毒性,以保证有足够数目的细胞处于有丝分裂状态。使用 处理时,推荐使用 见式()、式()或 见式()、式()来评价选用的细胞系的细胞毒性。犛(犇)(犕)犜()式中:犛 单个核细胞数;犇 双核细胞数;犕 多核细胞数;犜 细胞总数。细胞阻滞烄烆 烌烎 ()式中:试验样品组的胞质分裂阻断增殖数;阴性对照组或未处理对照组的胞质分裂阻断增殖指数。犇(犕)犜犇(犕)犜 ()式中:犢犢犜 犇 试验样品组双核细胞数;犕 试验样品组多核细胞数;犜 试验样品组细胞总数;犇 阴性对照组或未处理对照组双核细胞数;犕 阴性对照组或未处理对照组多核细胞数;犜 阴性对照组或未处理对照组细胞总数。细胞阻滞()()
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