细胞数的测定(血球计数板的使用方法).doc

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细胞数的测定
一、目的与要求
了解血球计数板计数的原理，学会测定细胞总数方法。
二、原理
用血球计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。血球计数板是一块特制的厚载玻片，其上由四条槽构成三个平台，中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小格（即16x25），另一种是一个大方格分成25个中方格，每个中方格又分为16个小方格（即25×16），但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个，每一个大方格边长为1 mm，则每一个大方格的面积为1 mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1 mm3

三、血球计数板的使用方法
（一）菌悬液的制备 为便于计数，对样品进行适当稀释，稀释程度以每小格内含5～10个酵母为宜，可采用10倍系列稀释法。
（二）加菌悬液样品 将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余水液。由盖玻片边缘或槽内加入计数板来回推压盖玻片，使其紧贴在计数板上，计数室内不能有气泡。静置5-10分钟。
（三）显微镜计数在低倍镜下找到小方格网后更换高倍镜观察计数，上下调动细螺旋，以便看到小室内不同深度的菌体。位于分格线上的菌体，只数两条边上的，其余两边不计数。如数上线就不数下线，数左边线就不数右边线。当芽孢菌体达到母细胞大小的二分之一时，可记作两个细胞。
（四）计数时若使用刻度为25×16（大格）的计数板，则数四角的4个大格（即100小格）内的菌数。如用刻度为16×25（大格）的计数板，除数四角的4个大格外，还需数中央1个大格的菌数（即80小格）。每小格中菌数以5-10个为宜，如菌液过浓可适当稀释。
（五）每个样品重复计数2-3次，取其平均值，按下式计算样品中的菌数。
（六）计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用电吹风吹干。
计数时，如果使用16×25的计数板，要按对角线方位取左上、左下、右上、右下上述4个中格进行计数（即计数100个小格中的细胞数）,如果使用25×16规格的计数板，则除了计数上述4个中格外，还要计数中央的1个中格，即计数80个小格中的细胞数，分别按下述公式计算出细胞数。
（1）16×25格的血球计数板计算公式：
1mL 细胞数＝---------------------×400×104×稀释倍数
（2）25×16格的血球计数板计算公式：
1mL 细胞数=-----------------------×400×104×稀释倍数
四，材料与仪器
菌悬液，显微镜，血球计数板，载玻片，盖玻片，接种环，吕氏美蓝
五、实验报告
次数
1
2
中格序号
左上
左下
右上
右下
中
左上
左下
右上
右下
中
细胞数

细胞总数

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