细胞培养与病毒培养实验步骤.doc

实验二 传代细胞培养与病毒在传代细胞中的培养
一、实验目的
了解倒置显微镜的构造与使用，了解不同传代细胞的形态及接毒后的病变特征，掌握细胞的传代培养方法、病毒接种方法及收毒方法。
二、常用细胞的种类
BHK-21：仓鼠肾传代细胞
PK-15：猪肾传代细胞
IBRS-2：猪肾传代细胞
Hela：人的子宫瘤细胞
Vero：非洲绿猴肾细胞
Marc-145：来源于Vero细胞
TK-143：人的胸苷激酶阴性细胞
Sf9：昆虫细胞
三、材料
1、100ml细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头
2、BHK-21（baby hamster kidney）细胞
3、0.25%胰酶
4、生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM
维持液：含2-5%犊牛血清、200U/ml青、链霉素的DMEM

5、伪狂犬病病毒液（PRV）
四、传代细胞培养的条件要求
1）细胞密度：2-3×105个/ml
2）pH范围 最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8
3）培养温度
哺乳动物细胞一般为37℃
昆虫细胞28-30℃
五、常用细胞分散剂与作用原理
1、胰酶 使精氨酸或赖氨酸的羧基和其他氨基酸的氨基之间的多肽链发生水解，导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散的单个细胞。
2、乙二胺四乙酸二钠（EDTA）：与二价钙、镁离子结合，从而使细胞分散。
3、灰色链丝菌酶 ：由灰色链丝菌提取的一种酶制剂，是蛋白酶、氨肽酶和羧肽酶的混合物。
六、营养液
1、人工综合营养液
氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嘌呤、嘧啶、辅助生长因子。
2、血清
1）血清的种类
胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。
2）血清的处理

无菌采集，过滤除菌。用前56℃灭活30min。
3）血清的作用
A、能提供细胞生存、生长和增生所必须的生长调节因子。
B、能补充基础培养液中没有或量不足的营养成分。
C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附和铺展的生长基质成分。
D、有中和毒性物质保护细胞不受伤害的作用。
E、给培养液提供良好的缓冲系统。
F、提供蛋白酶抑制剂，保护细胞免受细胞释放的蛋白酶的损害。
4）应用血清存在的问题
A、血清中存在不少有害于细胞生长和繁殖的物质：补体、免疫球蛋白、生长抑制因子。
B、血清的成分不明确，影响对结果的分析。
C、不同动物、不同批次的血清成分和活性差别较大，使得培养结果不稳定。
七、传代细胞系培养
1、优点：1) 可以无限的传代。
2) 不少细胞系对病毒很敏感。
3) 某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。
4) 生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。
2、缺点：在传代过程中遭到支原体和病毒的污染。
3、培养方法

1）取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液。
2）加入2ml 胰酶消化液，于37℃培养箱放置几分钟，至细胞间出现空隙或细胞变圆后，倒去消化液。
3）加入生长液,反复吹打几次，使细胞分散成单个细胞，然后分装于3个小瓶中。再在每个小瓶中补充生长液至10ml，然后置37℃培养箱培养，培养1-2天即可长成单层。
八、病毒（PRV）在传代细胞中的培养
1、选长满单层的细胞，倒掉培养液。
2、加入适量的病毒悬液
3、置温箱中感作（吸附）45min-1h。
4、取出瓶子，倒掉或不倒掉培养液，补足维持液，置温箱中继续培养，直至80%以上的细胞病变。
5、收毒：将病变的细胞置于-20℃冰箱中，冻结后取出自然解冻，在解冻过程中振摇几次，以使细胞完全从瓶壁上脱落。然后将病毒液收集于盐水瓶或其它容器中。低温贮藏备用。

实验三、原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）
一、实验目的
了解不同原代细胞的形态，掌握鸡胚成纤维细胞的制备与培养方法。
二、材料
1、9-11日龄鸡胚
2、照蛋灯与蛋座

3、碘酊棉球与酒精棉球
4、大剪子、眼科剪、小镊子
5、平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶、
6、胰酶、生长液、维持液
三、细胞培养的条件要求
1）细胞密度
原代细胞：4-6×105个/ml
传代细胞：2-3×105个/ml
2）pH范围 最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8
3）培养温度
哺乳动物细胞一般为37℃
昆虫细胞28-30℃
四、操作步骤
1、取9-12日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒气室部。
2、无菌操作下用剪子去除气室部卵壳，去除壳膜，穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚颈部，取出鸡胚放于灭菌平皿中。
3、用眼科剪、镊去除鸡胚头、四肢及内脏，用DMEM冲冼2次。
4、将冲洗后的鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜状。
5、将剪碎的组织块倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶中，用DMEM充分冲洗，并静置几分钟，待组织块下沉，吸弃上层液体，再加DMEM。如此反复冲洗2-3遍。

6、于沉淀组织块内加入约4倍量的0.25%胰酶，并调pH至7.6-7.8，振荡混匀后置37℃水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次，使细胞消化完全（组织块变散松，沉降渐变缓慢时即表示消化足够）。
7、取出，静置几分钟，小心吸弃上层胰酶溶液，用DMEM轻洗2次后，加入生长液5ml，用大口径吸管反复吹打，使细胞游离。
8、静置几分钟，使未消化好的组织块下沉。
9、细胞计数
取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%结晶紫—枸椽酸（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10min，充分振荡后进行计数。
按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数（N）。
每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K（稀释倍数）。
活细胞数应在90%以上。
10、将计数好的细胞稀释到合适的浓度，使细胞量约为4-6×106个/ml，分层于细胞培养瓶中，每瓶1ml，再补加DMEM生长液至10ml，盖上盖子，置于37℃恒温箱中培养。
○表示可计数

●表示不计数

五、结果的观察
于培养后每天观察结果，至长层单层。细胞量较大时，一天即可长成单层，细胞呈纤维状。

实验四 病毒感染力的滴定（TCID50的测定）
一、实验目的
了解病毒感染力测定的几种常用方法，掌握半数细胞培养物感染量TCID50的操作步骤、计算方法及含义。
二、测定病毒感染力的方法
半数致死量LD50( 50% lethal dose)：用动物或鸡胚来检测
半数鸡胚感染量EID50(egg 50% infective dose)：用鸡胚来检测

半数细胞培养物感染量TCID50（50% tissue culture infective dose)：用细胞来检测
蚀斑形成单位（plaque forming unit，PFU）：用细胞来检测
三、材料
1、长满单层的细胞1瓶
2、胰酶、吸球、吸管、生长液
3、96孔细胞培养板
4、加样器、枪头
5、病毒液（PRV）
四、TCID50的操作步骤
1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1-10-10。
2、将稀释好的病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8 孔，每孔接种100µl。
3、在每孔加入细胞悬液100µl，使细胞量达到2~3×105个/ml。
4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。（100µl生长液+100µl细胞悬液）
5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。
6、结果的计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法
五、TCID50的计算方法 CPE：细胞病变效应　
1、Reed-Muench两氏法
病毒液稀释度
出现CPE孔数
无CPE孔数
累 计
出现CPE孔所占的%

CPE孔数
无CPE孔数

10-1
8
0
27
0
100（27/27）
10-2
8
0
19
0
100（19/19）
10-3
7
1
11
1
91.6 （11/12）
10-4
3
5
4
6
40（4/10）
10-5
1
7
1
13
0.7（1/14）
10-6
0
8
0
21
0（0/21）
CPE：Cytopathic effect
距离比例＝（高于50%病变率的百分数-50%）/（高于50%病变率的百分数-低于50%病变率的百分数）
  ＝（91.6-50）/（91.6-40）
＝ 0.8
lgTCID50=距离比例×稀释度对数之间的差+高于50%病变率的稀释度的对数
=0.8×(-1)+(-3)
=-3.8
TCID50=10-3.8/0.1ml
含义：将该病毒稀释103.8接种100µl可使50%的细胞发生病变。
2、Karber法
病毒液稀释度
出现CPE的孔数
出现CPE孔的比率
10-1
8
8/8=1
10-2
8
8/8=1
10-3
7
7/8=0.875
10-4
3
3/8=0.375
10-5
1
1/8=0.125
10-6
0
0/8=0

lgTCID50=L-d(s-0.5)
L：最高稀释度的对数
D：稀释度对数之间的差
S：阳性孔比率总和
lgTCID50=-1-1×(3.375-0.5)
=-3.875
TCID50=10-3.875/0.1ml
含义：将该病毒稀释103.875接种100µl可使50%的细胞发生病变。

实验五 血清中和试验
一、实验目的
了解中和试验的基本原理和几种不同的测定方法，掌握固定病毒—稀释血清法的操作步骤和计算方法及含义。
二、原理
抗体与相应的病毒粒子特异性地结合，使病毒的感染力丧失。
三、用途
1、疾病诊断
2、病毒分离株的鉴定
3、不同病毒株的抗原关系研究

4、疫苗免疫原性的评价
5、免疫血清的质量评价
6、测定实验动物血清中是否存在抗体
四、分类
(一) 蚀斑（痘斑）减数试验
将病毒—正常血清混合物以及病毒—待检血清混合物分别接种到单层细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，进行蚀斑测定，比较病毒—正常血清组和病毒—待检血清组产生的蚀斑数，两者的差数表示待检血清的中和能力。
以试验组的蚀斑数比对照组减少50%作为判定依据，血清稀释度就是其蚀斑减数试验效价。
(二) 交叉保护试验
先将实验动物进行主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击，根据实验动物被保护的情况，判定待检V的种类或型别。这一方法的缺点是试验周期太长，并且需要大量的实验动物。可用于以下几方面：应用已知V鉴定未知V ；应用已知免疫血清鉴定未知V；应用已知V鉴定未知血清。
（三）终点法中和试验
1、固定病毒—稀释血清法
将不同稀释度的血清与固定量的病毒液（一般为100或200个TCID50、EID50或LD50）混合，置适当的条件下感作一定时间，再将血清-病毒混合物接种于敏感细胞、鸡胚或实验动物，测定被检血清阻止组织培养细胞、鸡胚或实验动物发生病毒感染的能力及其效价。
以能保护50%组织培养细胞、鸡胚或实验动物不发生病变、感染或死亡的血清最高稀释倍数，作为该血清的50%中和效价（PD50）。
2、固定血清——稀释病毒法

在固定量的血清中，加入等量不同稀释度的病毒，用对照非免疫血清（对照组）和待检血清同时进行测定，计算每一组的TCID50、EID50或LD50，然后计算中和指数。
五、材料
1、长满单层的细胞1瓶
2、胰酶、吸球、吸管、生长液
3、96孔细胞培养板
4、加样器、枪头
5、病毒液（PRV）
6、待检血清、PRV阳性对照血清、PRV阴性对照血清
六、操作步骤
1、固定病毒—稀释血清法
1）测定病毒液的TCID50
2）将测好TCID50的病毒液稀释成200个TCID50的病毒悬液。
3）在96孔微量培养板中将血清（预先56℃灭活30min）作连续倍比稀释（具体方法是在96孔板中先加入50µl生长液，再加50µl待检血清，混匀后，吸50µl至下一孔，如此下去。一直到1∶256），每个稀释度作4孔。
4）在上述各孔内加入50µl稀释好的病毒液，混匀后放入37℃ 5%CO2培养箱中作用45min-60min。
5）同时设待检血清毒性对照，阴、阳性血清对照，病毒对照和正常细胞对照，其中病毒对照要作 200个TCID50、20个TCID50、2个TCID50、0.2个TCID50 4个不同浓度的对照。
6）感作完成后每孔加入100µl细胞悬液，放37℃ 5%CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果，一般要观察5-7天。

7）结果计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法进行。
血清稀释度
CPE孔数
无CPE孔数
累计
保护率%
CPE孔数
无CPE孔数
1∶2（10-0.3）
0
4
0
15
100（15/15）
1∶4（10-0.6）
0
4
0
11
100（11/11）
1∶8（10-0.9）
1
3
1
7
87.5（7/8）
1∶16（10-1.2）
1
3
2
4
66.7（4/6）
1∶32（10-1.5）
3
1
5
1
16.7（1/6）
1∶64（10-1.8）
4
0
9
0
0（0/9）
1∶128（10-2.1）
4
0
13
0
0（0/13）
1∶256（10-2.4）
4
0
17
0
0（0/17）
距离比例=（高于50%的保护率-50% ）/（高于50%的保护率—低于50%的保护率）

=（66.7-50）/（66.7-16.7）

=-1.2+0.33×(-0.3)

=-1.299

lgPD50=高于50%的保护率的血清稀释度的对数+距离比例×稀释度对数的差

PD50=-1.299的反对数=0.05=1/20

=0.33

即1∶20稀释的待检血清可保护50%的组织培养细胞免于出现CPE。
2、固定血清——稀释病毒法
1）将病毒作连续10倍稀释
2）将稀释好的病毒接种96孔板，每个稀释度接种一纵排共8孔，每孔50μl，做两块板子。在其中一块板子的每孔加入50μl待检血清（试验组），另一块板子的每孔加入

50μl正常血清（对照组），混合后置37℃ 5%CO2培养箱作用1h。
3）然后在每孔中加入100μl细胞悬液。
4）设两纵排正常细胞对照。
5）置37℃ 5%CO2培养箱培养，逐日观察并记录结果。
6）分别计算每组病毒的TCID50，然后计算血清的中和指数。
中和指数=试验组TCID50 /对照组TCID50
如：中和指数=10-4.0/10-7.0 =103.0=1000
判定标准：以待检血精的中和指数大于50者，判为阳性；10-49为可疑；小于10为阴性。

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