宏基因组测序关键技术检验方法.docx

宏基因组测序技术检测标准
介绍：
宏基因组测序介绍
         宏基因组学是以环境样品中微生物群体基因组为研究对象，经过现代基因组技术手段包含功效基因筛选和测序分析，对环境中微生物多样性、种群结构、进化关系、功效活性、相互协作关系和环境之间关系进行研究新微生物研究方法。伴随高通量测序技术发展，为宏基因组学研究提供了新理想研究方法。高通量测序方法无需分离环境中多种微生物，也无需构建克隆文库就能够直接对环境中全部微生物进行测序。能够真实客观反应环境中微生物多样性、种群结构、进化关系等。现在又能够分为针对16s DNA/18sDNA/ITS测序和针对宏基因组全序列测序研究。下面就是对这二者具体介绍。
一、16s DNA/18s DNA/ITS测序
         16sDNA是最常见微生物物种分子判定标签，，经过对样品中16sDNA测序能够判定其中微生物物种丰度和分布情况。 现在，普遍使用Roche 454平台来对环境样品进行16s DNA测序。因为16s DNA序列比较相同，读长短话，难以进行有效比对，而454平台平均读长在400bp左右，能够很好避免这类问题。
二、宏基因组全测序
         在这种测序方法中，我们能够假定一个环境中全部微生物就是一个整体，然后对其中全部微生物进行测序。这么我们就能够研究样品中功效基因和其在环境中所起作用而不用关心其来自哪个微生物。能够发觉新基因，能够进行基因估计，甚至有可能得到某个细菌基因组全序列。另外，该项测序不单能够针对DNA水平，也能够针对全RNA进行基因表示水平研究。 
样品处理：
宏基因组样品搜集关键有口腔，下呼吸道痰液，下呼吸道灌洗液，皮肤和粪便。样品采集遵照样品采集规范（人）所要求操作来进行。尽可能留足备份样品。
核酸提取：
宏基因组核酸提取关键有两种方法：膜过滤法和直接裂解提取。对于液体样品如痰液，灌洗液两种方法全部适用，对于固体样品如粪廉价采取直接裂解方法。核酸提取后用NanoDrop ND-1000测定，260/280 = 1.8-2.0， 260/230 = 1.8-2.0，电泳检测DNA应是完整一条带。
测序Sequencing
1) 16S/18S测序：
Sanger测序：
用于低通量16S/18S DNA测序，提取宏基因组后，首先经过PCR将16S/18S序列扩增出来，再将其连接到克隆载体上，导入感受态细胞，涂平板做蓝白斑筛选，选出阳性克隆提质粒，对质粒进行测序反应，测序反应后纯化后用ABI 3130或ABI 3730进行毛细管电泳测序。
因为其测序正确率比较高，而通量很低，现通常见做二代测序结果验证。
454 Platform：
454平台关键包含两种测序系统：454 GS FLX+ System和454 GS Junior System。454 GS FLX+ System测序读长能够达成600-1000bp，通量450-700M，GS Junior System测序读长在400bp左右，通量在35M。

文库构建：
用fusion Primer扩增核糖体RNA，将已扩增rRNA直接做乳液PCR，在GS FLX+ 和GS Junior系统上进行测序。
测序深度：
数据分析：
使用无偿软件包对微生物种群多样性进行判定，并进行比较。
1. MEGAN：一个宏基因组分析工具，能够在大量测序数据中对测序结果进行聚类分析。
2. MG-RAST：用于注释宏基因组样品全自动软件。
3. IMG/M：基于宏基因组序列微生物群体功效性。
4. CAMERA：致力于微生物生态学研究。
5. CARMA：能够经过未拼接序列来进行物种组成和微生物遗传潜力研究。
6. GALAXY：用于高等真核生物研究，比如昆虫等。
7. Greengenes：16S rRNA数据库，能够用来做16S rRNA比对。
8. QIIME：针对454测序数据宏基因组分析。
9. The Ribosome Database Project（RDP）：针对焦磷酸测序分析方法。
Miseq Platform：
Miseq平台读长能够是2X250bp或2X300bp。使用Miseq Reagent Kit V2能够产出7.5-8.5Gb数据，使用Miseq Reagent Kit V3能够产出13.2-15Gb数据。

文库构建：
依据感爱好片段设计引物，经过PCR扩增出片段做为模板构建文库。使用Nextera XT Sample Prep Kit构建文库，根据试剂盒说明书操作。将建好文库归一化处理并将其混到一起。在Miseq系统里自动进行成簇反应，进而完成测序。
文库检验：
用Agilent 2100检测文库大小片段是否和预期一致。文库片段是否集中。
测序深度：
16S rRNA测序深度应最少在50,000条reads以上，以确保很好覆盖度。
数据分析：
对微生物生态进行定量观察
Greengenes：16S rRNA基因数据库和分析工具；
宏基因组分析工具：MEGAN
核糖体数据库计划(RDP)
Ion Torrent Platform：
Ion Torrent平台关键有两个测序系统：Ion PGM System和Ion Proton System。Ion PGM有两种读长，200bp和400bp，Ion PGM关键应用三种芯片，Ion 314 Chip，Ion 316 Chip和Ion 318 Chip，最多数据产出能够达成2Gb。Ion Proton读长为200bp，最多数据产出可达成10Gb。
文库构建：
使用Ion Plus Fragment Library Kit为16S rRNA扩增产物加上barcode标签，一共有96个barcode能够选择。加上标签后使用Ion PGM™ Template OT2 200 Kit在Ion OneTouch™ DL System上进行乳液PCR，完成文库构建。测序时依据需要不一样读长选择不一样测序试剂盒。
测序深度：
对于人体肠道微生物16S rRNA测序，对于检测高丰度样品，每个样品最少要测10000条reads，而对于检测低丰度样品，则需要1,000,000以上reads数。
2) 全宏基因组测序Whole-metagenomics Sequencing
Roche 454 platform:
文库构建：
提取宏基因组DNA，总量不低于10ug，且样品DNA应相对完整。使用GS FLX Titanium Rapid Library Preparation Kit构建文库，根据说明书进行对应操作。
文库检验：
DNA reads数和微球百分比在8%左右，能够达成比较理想测序结果。
测序深度：
每个样品应最少确保10,000条以上reads数。
Hiseq platform:
Hiseq平台关键有Hiseq 和Hiseq 2500两个测序系统。Hiseq 测序读长是2X100bp Paired-end测序，一次运行通量可达600Gb以上，Hiseq 2500有两种运行模式：快速运行和高通量，快速运行能够达成2X150bp，产生最多180Gb数据，高通量读长在2X125bp，数据产出在600Gb以上。
文库构建：
将提取宏基因组DNA用Covaris M220片段化后，使用Truseq DNA XT/LT Sample Prep Kit (illumina)根据protocol进行文库构建，DNA起始投入量应在1ug以上。
文库检验：
将建好宏基因组文库使用KAPA SYBR FAST ABI Prism 2X qPCR Master Mix (KAPA Biosystems) 试剂盒，利用ABI 7500荧光定量PCR仪，测定文库浓度。文库浓度必需大于2nM。
使用DNA 1000分析试剂（Agilent），利用Agilent 2100生物分析仪分析文库片段长度范围和质量。文库片段大小范围在目标大小区间内且相对集中。
测序深度：
每个样品应最少测3,100,000条reads以确保比很好覆盖度。