人源化单克隆抗体的研究进展和应用课件.ppt

文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。单克隆抗体在理论和实践上的应用成为解决生物学和单克隆抗体在理论和实践上的应用成为解决生物学和医学等许多重大问题的重要手段。但是，上述应用的单抗医学等许多重大问题的重要手段。但是，上述应用的单抗属于属于鼠源性鼠源性，鼠源性单抗应用于人类鼠源性单抗应用于人类的临床应用结果反映的临床应用结果反映出了单克隆抗体药物存在的一些问题出了单克隆抗体药物存在的一些问题:(1)鼠鼠源源性单抗容易性单抗容易容易容易产生产生人抗鼠抗体人抗鼠抗体(HAMA),在体内在体内作为作为异源蛋白异源蛋白被清除掉，被清除掉，从而削弱其治疗的有效性从而削弱其治疗的有效性。(2)鼠源性单抗在人体鼠源性单抗在人体内内生物活性降低，生物活性降低，不能有效地激活不能有效地激活人体的生物效应。人体的生物效应。研究背景研究背景因此，因此，人们一直致力于人源性抗体的研究人们一直致力于人源性抗体的研究。文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。人源化治疗性单克隆抗体的研究进展人源化治疗性单克隆抗体的研究进展构建的基本思路构建的基本思路 鼠抗体人源化就是通过鼠抗体人源化就是通过基因改造基因改造，使其和人体内的抗体，使其和人体内的抗体分子具有极其相似的轮廓，从而逃避人免疫系统的识别，避分子具有极其相似的轮廓，从而逃避人免疫系统的识别，避免诱导免诱导HAMAHAMA（人抗鼠抗体）反应。（人抗鼠抗体）反应。遵守两个原则遵守两个原则 首先，要保持抗体的亲和力和特异性；首先，要保持抗体的亲和力和特异性；其次，要降低或消除抗体的免疫原性。其次，要降低或消除抗体的免疫原性。文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。以分子生物学技术提取、扩增编码人抗体的以分子生物学技术提取、扩增编码人抗体的DNADNA，构建质粒，建立组合抗体文库，再利用供，构建质粒，建立组合抗体文库，再利用供者文库建立针对某一特定抗原的子文库。者文库建立针对某一特定抗原的子文库。以该技术制备的以该技术制备的抗体片段抗体片段(Fab)(Fab)是人源抗体是人源抗体，具有建库简单、抗体表达稳定等特点。迄今已有具有建库简单、抗体表达稳定等特点。迄今已有多种抗体产生。可以预见，该技术具有良好的发多种抗体产生。可以预见，该技术具有良好的发展和应用前景。展和应用前景。解决方案：解决方案：（1 1）用人脾细胞与鼠骨髓瘤细胞杂交；）用人脾细胞与鼠骨髓瘤细胞杂交；（2 2）用）用EBEB病毒转化人的病毒转化人的B B淋巴细胞；淋巴细胞；（3 3）用基因工程法制备嵌合抗体等。）用基因工程法制备嵌合抗体等。效果不强效果不强（4 4）最新方法：）最新方法：抗体库筛选技术和转基因鼠技术抗体库筛选技术和转基因鼠技术文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。单克隆抗体的发展史单克隆抗体的发展史第一代：鼠源性单抗第一代：鼠源性单抗 药物特异性很强，副作用大，现在已经渐渐退出市场。药物特异性很强，副作用大，现在已经渐渐退出市场。不过由于其代谢比较快，目前在放射性元素标记的单克隆不过由于其代谢比较快，目前在放射性元素标记的单克隆抗体药物中使用。抗体药物中使用。第二代：人鼠嵌合性单抗第二代：人鼠嵌合性单抗 进行人源化改造，使其人源化程度达到进行人源化改造，使其人源化程度达到70%70%左右。左右。第三代：第三代：CDRCDR移植抗体和移植抗体和SDRSDR移植抗体移植抗体人源化程度达到人源化程度达到95%95%左右，大大降低了毒副作用。左右，大大降低了毒副作用。第四代：全人源化单抗第四代：全人源化单抗 2002 2002年，的世界首个药物年，的世界首个药物阿达木单抗上市。人源阿达木单抗上市。人源化及全人源单克隆抗体由于副作用小，在体内停留时间长，化及全人源单克隆抗体由于副作用小，在体内停留时间长，更有利于治疗更有利于治疗。文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。人源化程度人源化程度文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。1.1.嵌合抗体（嵌合抗体（Chimeric antibody)Chimeric antibody)用人源基因代替鼠源单抗的恒定区，即该单抗由用人源基因代替鼠源单抗的恒定区，即该单抗由鼠的可鼠的可变区变区和和人的恒定区人的恒定区组成的嵌合抗体。组成的嵌合抗体。由于嵌合抗体可变区（由于嵌合抗体可变区（V V）约占整个抗体的）约占整个抗体的30%30%，鼠源，鼠源性抗体性抗体V V区中的框架区（区中的框架区（FR)FR)仍残留一定的免疫原性，可仍残留一定的免疫原性，可诱导诱导HAMAHAMA反应。反应。灵长目源抗体也是灵长目源抗体也是一类嵌合抗体，通过免一类嵌合抗体，通过免疫短尾猿猴产生。由于疫短尾猿猴产生。由于其抗体的可变区与人可其抗体的可变区与人可变区无差异，不至于发变区无差异，不至于发生抗体反应。生抗体反应。缺点缺点解决方案解决方案鼠源抗体鼠源抗体嵌合抗体嵌合抗体文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。2.CDR移植抗体（移植抗体（CDR grafted antibody)真正意义上的抗体人源化。抗体中除了真正意义上的抗体人源化。抗体中除了3 3个个互补决定区互补决定区（CDRCDR）是鼠源的外，其余全部是人源结构，人源化程度可）是鼠源的外，其余全部是人源结构，人源化程度可达到达到95%95%以上，具有更高的安全性和更低的毒性。以上，具有更高的安全性和更低的毒性。不足不足 有时异基因的有时异基因的CDRCDR人源化抗体可能引起抗个体基因型人源化抗体可能引起抗个体基因型反应。反应。改良方案改良方案进行进行SDRSDR移植改良移植改良嵌合抗体嵌合抗体人源化抗体人源化抗体3个个CDR文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。3.SDR3.SDR移植抗体移植抗体(SDR grafted antibody)(SDR grafted antibody)在在CDRCDR移植抗体的基础上，将异源抗体中与抗原结移植抗体的基础上，将异源抗体中与抗原结合密切相关的合密切相关的SDRSDR等等少数残基少数残基移植到人抗体相应位置上，移植到人抗体相应位置上，进一步降低了抗体的异源性。通过这种方法，使人源化进一步降低了抗体的异源性。通过这种方法，使人源化的抗体潜在的免疫原性降至最低。的抗体潜在的免疫原性降至最低。文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。4.4.全人单克隆抗体（全人单克隆抗体（Fully humaneantibody)Fully humaneantibody)它是将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转它是将体外克隆的抗体基因片段插入噬菌体载体，转染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单染工程细菌进行表达，然后用抗原筛选即可获得特异的单克隆噬菌体抗体。克隆噬菌体抗体。在在HIVHIV等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的等病毒感染和肿瘤的诊断与治疗方面有其独特的优越性。优越性。4.1.4.1.抗体库筛选技术抗体库筛选技术4.1.1.4.1.1.噬菌体表面展示技术噬菌体表面展示技术鼠源抗体鼠源抗体完全人源化抗体完全人源化抗体文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。基本原理和程序基本原理和程序噬菌体抗体库噬菌体抗体库人免疫细胞基因组人免疫细胞基因组PCR技术扩增技术扩增整套整套的抗体重链可变区（的抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（）和轻链可变区（VL）基因）基因噬菌体噬菌体DNA中有抗体基因中有抗体基因外壳表面有抗体分子的表达外壳表面有抗体分子的表达克隆并以融合蛋白的形式表达克隆并以融合蛋白的形式表达基因重组基因重组噬菌体重组噬菌体重组DNA构建构建利用抗原利用抗原-抗体特异性抗体特异性筛选所需抗体并进行克隆扩增筛选所需抗体并进行克隆扩增获得可溶性抗体片段获得可溶性抗体片段表达表达文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。局限性局限性1.在噬菌体展示过程中涉及细菌转化、噬菌体包装、展示在噬菌体展示过程中涉及细菌转化、噬菌体包装、展示跨膜分泌，这就大大限制了所建库的容量和分子的多样性。跨膜分泌，这就大大限制了所建库的容量和分子的多样性。目前，常用的噬菌体展示文库容量在目前，常用的噬菌体展示文库容量在109。2.不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为不是所有的序列都能在噬菌体中获得很好的表达，因为有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导有些蛋白质功能的实现需要折叠、转运、膜插入和络合，导致在体内筛选时需要外加选择压力。致在体内筛选时需要外加选择压力。3.噬菌体展示文库无法进行有效的体外突变和重组进而限噬菌体展示文库无法进行有效的体外突变和重组进而限制了文库中分子遗传的多样性。制了文库中分子遗传的多样性。4.因为噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以一因为噬菌体展示系统依赖于细胞内基因的表达，所以一些对细胞有毒性的分子（如生物毒素分子些对细胞有毒性的分子（如生物毒素分子)很难得到有效表很难得到有效表达和展示。达和展示。文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。4.1.2.4.1.2.核糖体展示技术核糖体展示技术基本原理和程序基本原理和程序人免疫细胞基因组人免疫细胞基因组EDTA体外转录、翻译、偶联体外转录、翻译、偶联mRNA-核糖体核糖体-蛋白质三聚体蛋白质三聚体核糖体展示的蛋白文库核糖体展示的蛋白文库构建构建基因型和表型联系基因型和表型联系利用抗原利用抗原-抗体特异性抗体特异性筛选所需抗体复合体筛选所需抗体复合体EDTA解离解离获得特异获得特异mRNART-PCRRT-PCR特异抗体特异抗体DNA子文库子文库获得特异性的、高亲和力的抗体获得特异性的、高亲和力的抗体表达表达文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。传统的筛选技术具有本身难以克服的缺陷，主要表传统的筛选技术具有本身难以克服的缺陷，主要表现在构建文库和筛选时都涉及细胞转染、噬菌体包装、现在构建文库和筛选时都涉及细胞转染、噬菌体包装、跨膜分泌和蛋白质降解等诸多方面的问题，文库容量及跨膜分泌和蛋白质降解等诸多方面的问题，文库容量及其分子多样性在某种程度上受到很大的限制，降低了文其分子多样性在某种程度上受到很大的限制，降低了文库筛选效率。库筛选效率。核糖体展示技术由于在体外无细胞翻译体系中进行，核糖体展示技术由于在体外无细胞翻译体系中进行，用用mRNA的可复制性，使靶基因（蛋白）得到有效富集，的可复制性，使靶基因（蛋白）得到有效富集，不受细胞转化效率的限制。它不受细胞转化效率的限制。它大大的提高了文库容量和大大的提高了文库容量和筛选通量（筛选通量（1012-1014）而且能够增加表达的蛋白质的溶）而且能够增加表达的蛋白质的溶解度。解度。优势优势文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。4.2.4.2.转基因小鼠转基因小鼠 通过基因敲除技术，使小鼠自身的基因失活，并导通过基因敲除技术，使小鼠自身的基因失活，并导入新基因，创造出携带人抗体重轻基因簇的转基因小入新基因，创造出携带人抗体重轻基因簇的转基因小鼠。这种人抗体基因小鼠所携带的人鼠。这种人抗体基因小鼠所携带的人DNADNA片段具有完善片段具有完善的功能，可以有效地进行同型转换和亲和力成熟。任的功能，可以有效地进行同型转换和亲和力成熟。任何靶抗原均可被用来免疫该小鼠，使其产生高亲和力何靶抗原均可被用来免疫该小鼠，使其产生高亲和力的人抗体。的人抗体。案例案例：日本麒麟公司用基因工程技术，使小鼠携带完整的日本麒麟公司用基因工程技术，使小鼠携带完整的人人1414号染色体，该染色体包含全部人抗体产生基因。号染色体，该染色体包含全部人抗体产生基因。但迄今尚无该技术生产的制品问世。但迄今尚无该技术生产的制品问世。文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。4.3.微胞杂交干细胞技术微胞杂交干细胞技术日本学者日本学者IshidaIshida等首先提出等首先提出技术要点：技术要点：首先将抗首先将抗G418G418的人成纤维细胞与小鼠的的人成纤维细胞与小鼠的A9A9细胞融细胞融合，通过筛选，得到抗合，通过筛选，得到抗G418G418的小鼠的小鼠A9A9细胞，再运用细胞，再运用PCRPCR或原位荧光杂交方法筛选，先筛选出的细胞用秋或原位荧光杂交方法筛选，先筛选出的细胞用秋水仙素处理水仙素处理48h48h，然后用细胞松弛素，然后用细胞松弛素B B处理并高速离心，处理并高速离心，分离出含分离出含2 2号、号、1414号、号、2222号染色体的小鼠号染色体的小鼠。人源抗体在这种转基因小鼠的产量还比较低。人源抗体在这种转基因小鼠的产量还比较低。文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。4.4.4.4.其他方法其他方法 XTL XTL生物制药公司使用一种类似于人骨髓移植的方法，生物制药公司使用一种类似于人骨髓移植的方法，用放射线破坏动物骨髓，然后注入人抗体生成细胞。该公用放射线破坏动物骨髓，然后注入人抗体生成细胞。该公司已用此法生产出一种全人单抗。司已用此法生产出一种全人单抗。文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。近年来近年来,人源化抗体和人抗体的出现为临床应人源化抗体和人抗体的出现为临床应用带来了新的希望用带来了新的希望,当前正处于临床研究的多当前正处于临床研究的多种抗体中种抗体中,嵌合抗体和嵌合抗体和 人人 源源 化化 抗抗 体体 所所 占占 比比 例例 大大 于于70%。目前的人源化抗体。目前的人源化抗体,主要用于主要用于肿肿瘤瘤、自身免疫性疾病自身免疫性疾病和和心血管疾病的治疗心血管疾病的治疗以以及及抗移植排斥反应抗移植排斥反应和和抗病毒感染抗病毒感染等方面。等方面。人源化抗体的临床应用人源化抗体的临床应用文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。1.在在肿瘤治疗肿瘤治疗方面的应用方面的应用:单抗药物抗肿瘤能有效地降低传统肿瘤药物治疗的不单抗药物抗肿瘤能有效地降低传统肿瘤药物治疗的不良反应良反应。如。如2005年我国开发出癌症治疗药年我国开发出癌症治疗药重组人源重组人源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体(商品名：泰欣生商品名：泰欣生)。泰欣生联合放疗治疗鼻咽癌的完全缓解率比单纯放疗的泰欣生联合放疗治疗鼻咽癌的完全缓解率比单纯放疗的患者提高患者提高30%以上。以上。2.在在器官移植器官移植中的应用中的应用:近年来近年来,利用抗体药物作为实体器官移植的诱导治疗利用抗体药物作为实体器官移植的诱导治疗逐渐增加。如逐渐增加。如1986年批准进入美国市场的治疗性抗体类年批准进入美国市场的治疗性抗体类药物药物抗抗 CD3单抗单抗即被用于肾、即被用于肾、心脏、心脏、肝脏移植排斥的逆肝脏移植排斥的逆转。转。3.在在心血管疾病心血管疾病方面的应用方面的应用：美国美国 FDA 于于 1994 年年批准了第一个批准了第一个人人-鼠嵌合鼠嵌合 Fab 抗体抗体的的上市上市，该抗体现，该抗体现已被广泛应用于多种心血管疾病治疗已被广泛应用于多种心血管疾病治疗,主要用于预防冠状动脉成形术后的再狭窄主要用于预防冠状动脉成形术后的再狭窄。文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。4.在在自身免疫性疾病自身免疫性疾病方面的应用方面的应用:现有的研究表明现有的研究表明,抗体对类风湿性关节炎、抗体对类风湿性关节炎、系系统性红斑狼疮、统性红斑狼疮、牛皮癣、牛皮癣、多发性硬化、多发性硬化、硬皮病、硬皮病、溃疡性结肠炎等疗效较好溃疡性结肠炎等疗效较好。5.在在抗病毒感染抗病毒感染方面的应用：方面的应用：近年来研究表明近年来研究表明,在在 HBV、HCV、HIV 等病毒等病毒感染性疾病中感染性疾病中,人源化抗体显示了较好的应用前景。人源化抗体显示了较好的应用前景。如：商品名为如：商品名为 SynagisTM的抗呼吸道病毒感染的抗的抗呼吸道病毒感染的抗体在美国已经上市体在美国已经上市,为人源化的基因工程抗体。为人源化的基因工程抗体。文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。应用单克隆抗体后的患者症状改善率应用单克隆抗体后的患者症状改善率文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。总结总结 到目前为止，至少有到目前为止，至少有3535个完全人类的单抗已经进入临床的个完全人类的单抗已经进入临床的治疗实验阶段。这些单抗的靶抗原都是临床癌症、自身免疫疾治疗实验阶段。这些单抗的靶抗原都是临床癌症、自身免疫疾病或炎症疾病和传染病中的主要抗原。例如病或炎症疾病和传染病中的主要抗原。例如EGFREGFR、CTLA-4CTLA-4和和CD4CD4等。在治疗一些异种移植、骨质疏松症等疾病已有显著的效果。等。在治疗一些异种移植、骨质疏松症等疾病已有显著的效果。抗体人源化以及抗体人源化以及完全人源化抗体完全人源化抗体的制备已经成为当今治疗的制备已经成为当今治疗性抗体的发展趋势，同时，各种性抗体的发展趋势，同时，各种抗体衍生物抗体衍生物免疫原性低、更易免疫原性低、更易通过血管壁到达病源，通过通过血管壁到达病源，通过PEGPEG化等方法可以延长其半衰期；人化等方法可以延长其半衰期；人抗体是否可以解决鼠抗体运用中出现的所有问题，还有待大量抗体是否可以解决鼠抗体运用中出现的所有问题，还有待大量临床试验的检验。所以可行的方法就是在完善人抗体技术的同临床试验的检验。所以可行的方法就是在完善人抗体技术的同时，推进治疗性小分子抗体衍生物的研究，根据临床的实际设时，推进治疗性小分子抗体衍生物的研究，根据临床的实际设计灵活有效的治疗方案，使人源化抗体和小分子抗体互为补充计灵活有效的治疗方案，使人源化抗体和小分子抗体互为补充。文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。Thanks!Thanks!