质谱讲义分析和总结.pdf
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1、*质 谱(MS)mass spectrometry质谱法是将样品离子化,变为气态离子混合物,并按质荷比(m/z)分离的分析技术;质谱仪是实现上述分离分析 技术,从而测定物质的质量与含量及其结构的仪器。质谱分析法是一种快速,有效的分析方法,利用质谱仪可进行同位素 分析,化合物分析,气体成分分析以及金属和非金属固体样品的超纯痕量分析。在有机混合物的分析研究中证明了质谱 分析法比化学分析法和光学分析法具有更加卓越的优越性,其中有机化合物质谱分析在质谱学中占最大的比 重,全世界 几乎有3/4仪器从事有机分析,现在的有机质谱法,不仅可以进行小分子的分析,而且可以直接分析糖,核酸,蛋白 质等生物大分子,在
2、生物化学和生物医学上的研究成为当前的热点,生物质谱学的时代已经到来,当代研究有机化合 物已经离不开质谱仪。一.仪器概述1.基本结构质谱仪由以下几部分组成供电系统进样系统离子源质量分析器检测接收器数据系统真空系统进样系统:把分析样品导入离子源的装置,包括:直接进样,GC,LC及接口,加热进样,参考物进样等。离子源:使被分析样品的原子或分子离化为带电粒子(离子)的装置,并对离子进行加速使其进入分析器,根据离子化 方式的不同,有机常用的有如下几种,其中EI,FAB最常用。EI(El ect ro n Impact Io nizat io n):电子轰击电离-最经典常规的方式,其他均属软电离,EI使用
3、面广,峰重现性好,碎片离子多。缺点:不适合极性大、热不稳定性化合物,且可测定分子量有限,一般41,000。口(Chemical Io nizat io n)化学电离核心是质子转移,与EI相比,在EI法中不易产生分子离子的化合物,在 CI中易形成较高丰度的M+H+或M-H+等准分子离子。得到碎片少,谱图简单,但结构信息少一些。与EI法同样,样品需要汽化,对难挥发性的化合物不太适合。*原理 R+e-R+.+2e.(电子电离)反应气为含H的R为反应气体分子R+.+R-RH+(R-H),分子例如异丁M为样品分子 RH+M-R+(M+H)+(质子转移)烷甲烷氨气R浓度 M浓度 R+.+M-R+M+.(电
4、荷交换)甲醇气等R+.+M(R+M)+.(加合离子)FD(Fiel d Deso rpt io n):场解吸大部分只有一根峰,适用于难挥发极性化合物,例如糖,应用较困难,目前基本被 FAB取代。FAB(Fast At o m Bo mbardment)快原子轰击利用氤氤80年代初发明,或者他离子枪(LSIMS,液体二次离子质 谱),高速中性原子或离子对溶解在基质中的样品溶液进行轰击,在产生爆发性汽化的同时,发生离子-分子反 应,从而引发质子转移,最终实现样品离子化。适用于热不稳定以及极性化合物等。FAB法的关键之一是,选择适当 的(基质)底物,从而可以进行从较低极性到高极性的范围较广的有机化合
5、物测定,是目前应用比较广的电离技术。不但得到分子量还能提供大量碎片信息。产生的谱介于EI与ESI之间接近硬电离技术。生成的准分子离子,一般常 见M+H+和M+底物+。另外:还有根据底物脱氢以及分解反应产生的容易提供电子的芳煌化合物产生M+.笛类化合物、氨基霉素等还产生M+NH/+糖芭、聚醛等一般可(产生)观察到M+Na+由底物与粒子轰击(碰撞)诱导发生还原反应来产生M+nH+(nl),二量体(双分子)M+H+M+及 M+H+B+等。因此,进行谱图解析时,要考虑底物和化合物的性质,盐类的混入等进行综合判断。ESI(El ect ro spray Io nizat io n):电喷雾电离一一与LC
6、,毛细管电泳联用最好,亦可直接进样,属最软的电离方式,混合 物直接进样可得到各组分的分子量。APCI(At mo spheric Pressure Chemical Io nizat io n):大气压化学电离 同上,更适宜做小分子。MALDI(Mat rix Assist ed Laser Deso rpt io n):基体辅助激光解吸基质辅助激光解吸电离是一种用于大分子离子化方法,利用对使用的激光波长范围具有吸收并能提供质子的基质(一般常用小分子液体或结晶化合物),将样*品与其混合溶解并形成混合体,在真空下用激光照射该混合体,基体吸收激光能量,并传递给样品,从而使样品解 吸电离。MALDI
7、的特点是准分子离子峰很强。通常将MALDI用于飞行时间质谱和FT-MS,特别适合分析蛋白质和 DNA等大分子。质量分析器:是质谱仪中将离子按质荷比分开的部分,离子通过分析器后才安不同质荷比(M/Z)分开,将相同的M/Z 离子聚焦在一起,组成质谱。检测接收器:接收离子束流的装置有:二次电子倍增器光电倍增管微通道板数据系统:将接收来的电信号放大、处理并给出分析结果。包括外围部分.例如终端显示器,打印机等。现代计算机接 口,还可反过来控制质谱仪各部分工作。真空系统:由机械真空泵(前极低真空泵),扩散泵或分子泵(高真空泵)组成真空机组袖取离子源和分析器部分的真 空。只有在足够高的真空下,离子才能从离子
8、源到达接收器,真空度不够则灵敏度低。供电系统:包括整个仪器各部分的电器控制部件,从几伏低压到几千伏高压。2.分类:常见下列几种:双聚焦扇形磁场-电场串联仪器(sect o r)四极质谱仪(Q)离子阱质谱仪(TRAP)飞行时间质谱仪(TOF)付利叶变换-离子回旋共振质谱仪(FT-ICRMS)混合型如四极+TOF,磁式+TRAP等串列式多级质谱仪(MS/MS)T三重四极ltof+tof3.分析原理:*磁质谱基本公式:M/Z=H2R2/2VM:质量Z:电荷V:加速电压R:磁场半径H:磁场强度磁质谱经典,可高分辨,质量范围相对宽;缺点是体积大,造价高,现在越来越少。四极分析器quadrupole是一种
9、被广泛使用的质谱仪分析器。由两组对称的电极组成。电极上加有直流电压和 射频电压(土(U+Vco sco t)相对的两个电极电压相同,相邻的两个电极上电压大小相等,极性相反。带电粒子射 入高频电场中,在场半径限定的空间内振荡。在一定的电压和频率下,只有一种质荷比的离子可以通过四极杆达到 检测器,其余离子则因振幅不断增大,撞在电极上而被过滤”掉,因此四极分析器又叫四极滤质器。利用电压或 频率扫描,可以检测不同质荷比的离子。优点是扫描速度快,比磁式质谱价格便宜,体积小,常作为台式进入常规实验室,缺点是质量范围及分辨率有限。飞行时间质谱仪:利用相同能量的带电粒子,由于质量的差异而具有不同速度的原理,不
10、同质量的离子以不同时间通过 相同的漂移距离到达接收器。公式 M/Z=2E/v2 v=d/t 代入 M/Z=Kt 2E:离子动能v:离子速度d:飞行距离t:飞行时间K:常数=2E/d2优点扫描速度快,灵敏度高,不受质量范围限制以及结构简单造价低廉等.FT-MS:在射频电场和正交横磁场作用下,离子作螺旋回转运动,回旋半径越转越大,当离子回旋运动的频率与补电场 射频频率相等时,产生回旋共振现象,测量产生回旋共振的离子流强度,经付立叶变换计算,最后得到质谱图。是较新的技 术,对于高质量数,高分辨率及多重离子分析彳艮有前途,但使用超导磁铁需要液氨,不能接GC,动态范围稍窄,目前还 不太作为常规仪器使用。
11、离子阱Ion trap通常由一个双曲面截面的环形电极和上下一对双曲面端电极构成。从离子源产生的离子进入离 子阱内后,在一定的电压和频率下,所有离子均被阱集。改变射频电压,可使感兴趣的离子处于不稳定状态,运动 幅度增大而被抛出阱外被接收、检测。用离子阱作为质量分析器,不但可以分析离子源产生的的离子,而且可以把 离子阱当成碰撞室,使阱内的离子碰撞活化解离,分析其碎片离子,得到子离子谱。离子阱不但体积很小,而且具 有多级质谱的功能,即做到MSn,但动态范围窄,低质量区1/3缺失,不太适合混合物定量.多级质谱联用仪*现在,几乎所有的商品质谱仪上均配有GC-MS,但对难挥发、强极性和大分子量混合物,GC
12、-MS无能为力,为了弥补GC-MS的不足,经过20多年的探索,通过开发上述几种软电离技术,特别是ESI和APCI等,解决了 LC 与离子源接口问题(1987年完成),从而实现了 LC-MS联用,是分析化学的一次重大进展,而串联质谱仪更具有 许多优点。串联质谱仪(MS/MS或Tamdem):离子源一T第一分析器一T碰撞室一T第二分析室一T接收器MSI MS2进行MS/MS的仪器从原理上可分为两类。第一类仪器利用质谱在空间中的顺序,是由两台质谱仪串联组装而 成。即前面列出的串列式多级质谱仪。第二类利用了一个质谱仪时间顺序上的离子储存能力,由具有存储离子的分 析器组成,如离子回旋共振仪(ICR)和离
13、子阱质谱仪。这类仪器通过喷射出其它离子而对特定的离子进行选择。在一个选择时间段这些被选择的离子被激活,发生裂解,从而在质谱图中观测到碎片离子。这一个过程可以反复观 测几代碎片的碎片。时间型质谱便于进行多级子离子实验,但另一方面不能进行母离子扫描或中性丢失。一般采用ESI、CI或FAB等软离子化方法,以利于多产生分子离子,通过MSI的离子源使样品离子化后,混和 离子通过第一分析器,可选择一定质量的离子作为母体离子,进入碰撞室,室内充有靶子反应气体(碰撞气体:He、Ar、Xe、CH4等)对所选离子进行碰撞,发生离子一分子碰撞反应,从而产生子离子,解 MS2的分析器及接受器 得到子离子(扫描)质谱(
14、pro duct io n spect run T嫩做 MS/MS-CID 谱,或者简称为 CID(co l l isio n-induced disso ciat io n)谱,碰撞诱导裂解谱,及MS/MS谱。另外,也有母找子离子的MS/MS谱,(MS/MS spreurso r io n spect rum)研究MS/MS谱(T错旨子离子质谱,与在源内裂解产生的正常碎片质谱类似,但有区别,现不能检索),可 以了解到被分析样品的混合物性质和成分,对一些混合物(目前,多用最软电离的ESI或APCI的MS/MSO不必进 行色谱分离可直接分析,与色谱法相比,有很快的响应速度,省时省样品省费用,具有
15、高灵敏度和高效率的优点。另外 一个特点是通过子一母及母一子MS/MS谱可以掌握一定的结构信息,做为目前有力的结构解析手段。因此,现在利用 串联质谱仪进行药物研究越来越得到重视,特别是在药物代谢以及混合物的微量成分分析和结构测定等方面 正在起到 越来越重要的作用。比较常用的三级四极型MS/MS,联用LC-MS/MS使用方便,操作简单,适合于定量等常规,大 型的MS/MS更适合结构解析。4.仪器性能指标 质量范围:表明一台仪器所允许测量的质荷比,从最小到最大值的变化范围.一般最小为2,实际10以下已经无用.*最大可达数万,利用多电荷离子,实际能达上百万。分辨率(R):是判断质谱仪的一个重要指标,低
16、分辨仪器一般只能测出整数分子量.高分辨率仪器可测出分子量小数点后第四位,因此可算出分子式,不需要进行元素分析,更精确。R=M/AM M为相邻两峰之一的质量数.AM为差例如:500与501两个峰刚好分开.则R=500/l=500若R=50000则可区别开500与500.01。对于四极杆仪器,通常做到单位分辨,高低质量区R数值不同.灵敏度:有多种定义方法,粗略地说是表示所能检查出的最小量,一般可达到10-9门0一12克甚至更低,实际还应看信噪 比。二.质谱的表示法及解析谱图法:横坐标代表质量数,纵坐标代表峰强度,是该质量离子的多寡的表示.常用,直观,但不太细致.还分为连续谱和棒 状图两种,一般日棒
17、图多,ESI连续谱多。列表法:质量数,相对丰度高分辨表示法:列表元素组成实测质量理论质量C H0N误差(PPM)相对丰度()322.1094322.107919 1641-4.6100322.110622 1412 3.7309.1358309.136519 1931 2.2801.几个术语:质荷比M/Z:一般Z为1,故M/Z也就认为是离子的质量数,蛋白质等易带多电荷,ZL在质谱中不能用平均分子 量计算离子的化学组成例如不能用氯的平均分子量35.5,而用35和37O同理溪也是如此,79和81,无80o在质谱 图中,根本不会出现35.5的峰。一氯苯的分子峰应是112和114而不是113o相对丰度
18、:以质谱中最强峰为100%(称基峰),其他碎片峰与之相比的百分数。总离子流(TIC):即一次扫描得到的所有离子强度之和,若某一质谱图总离子流很低,说明电离不充分,不能做为一张标 准质谱图。*动态范围:即最强峰与最弱峰高之比.早期仪器窄,现代计算机接收宽。若太窄,会造成有多个强峰出头,都成为基峰,而 该要的(常为分子峰)却记录不出来。这样的图也是不标准的检索、解析起来都很困难。本底:未进样时,扫描得到的质谱图,空气成分,仪器泵油,FAB底物,ESI缓冲液,色谱联用柱流失及吸附在离子源中其 他样品。因有以上三点,故要控制进样量及放大器放大倍数,还要扣除本底,以得到一张标准的质谱图。质量色谱图/Ma
19、ss chromatogram和质量色谱法/Mass chromatography(MC)又叫提取离子色谱图/extract ion chromatography:是质谱法处理数据的一种方式。在GC/MS或LC/MS中,选定一定的质量扫描 范围,按一定的时间间隔测定质谱数据并将其保存在计算机中。然后可以用各种办法调出质谱数据。如果要观察特定 质量与时间的关系,可以指定这个质量,计算机将以指定离子的强度为纵坐标,以时间作为横坐标,表示质量与时 间的关系。这种方法叫做质量色谱法。得到的图叫做质量色谱图或提取离子色谱图。2.离子的种类分子离子M+.,也有用M+.的。中性分子丢失一个电子时,就显示一个
20、正电荷故用M+。在EI中,继续生成碎片离子,在CI,FD,FAB等电离方法中,往往生成质量大于分子量的离子如 M+l,M+15,M+43,M+23,M+39,M+92.称准分子离子,解析中准分子离子与分子离子有同样重要的作 用。碎片离子:电离后,有过剩内能的分子离子,会以多种方式裂解,生成碎片离子,其本身还会进一步裂解生成质量更小 的碎片离子,此外,还会生成重排离子。碎片峰的数目及其丰度则与分子结构有关,数目多表示该分子较容易断裂,丰度高的 碎片峰表示该离子较稳定,也表示分子比较容易断裂生成该离子。如果将质谱中的主要碎片识别出来很!J能帮助判断 该分子的结构。(3)多电荷离子指带有2个或更多电
21、荷的离子,有机小分子质谱中,单电荷离子是绝大多数,只有那些不容易碎裂的基团或分子结构-如共姬体系结构-才会形成多电荷离子.它的存在说明样品是较稳定的.对于蛋白质等生物大分子,采用电喷雾的离子 化技术,可产生带很多电荷的离子,最后经计算机自动换算成单质/荷比离子。(4)同位素离子各种元素的同位素,基本上按照其在自然界的丰度比出现在质谱中,这对于利用质谱确定化合物及碎片的元素组成*有很大方便,在前面M/Z提到过,如氯35和37,后面还要讲,还可利用稳定同位素合成标记化合物,如:定等标记化合物,再用质谱法检出这些化合物,在质谱图外貌上无变化,只是质量数的位移,从而说明化合物结构,反应历程等。负离子通
22、常碱性化合物适合正离子,酸性化合物适合负离子,某些化合物负离子谱灵敏度很高,可提供很有用的信息。3.由质谱推断化合物结构质谱是一种语言,但需要翻译.与其他类型谱图比较,学习如何由质谱图识别一个简单分子要容易得多。质谱图直接给出分子及其碎片的质量,因此化学家不需要 10050学习任何新的知识。与解数学难题相似,例如M/Z水的质谱图,一看便知。但并不是随意拼凑质量数,是有规律可循的。如何看质谱图同位素峰C13下面四张质谱图分别为EI,Q,FAB,ESI源得到的结果,可看出差异很大.*Fi l e Na.m:C:USERDATAA1-7A.RAW Sampl e Nct me:Op缸at o r:国
23、家药物及代谢产物分析研究中心VG卒B 2f 250CDo EBDat e:06/17/98-14:38:15Scan No.14 1 o t al l F.No.464 Mass又8二oR.ang e 17-524 1?.,No.Ba-s e Peak:72.1 Hs i3 96rht:655 351 00-41372Fil e Na匹 C:USERD4T从Al 7ACLRA胄 泗 l e Ma毗:邹忠梅伽rat o r:国家药物及代谢产物分析研究中心VG Z-2f 250C CIDat e:10/23/98:-.16:03:31S o.n No.7-To t al P No.41 舶 ss
24、l,ange 60-S20 P.No.29归 se.Peak:12.Ol l He.ight:4114/-X1Of oI2,c.,p-IOS,巨,Im亡-(-s w mp 1 CT A 1-7A(u 1=00),ri-I 广叱,寸 升1.5-e 3 O 了 IL OO+070 e!.060.0 t 0 0100虫)do nil l0 5 0il l.5.00rn/z*The Language of MS Requirements for Translation Basic Vocabulary of mass spectrometry Numbers,Intensities,Compositi
25、ons Basic Rule Bookforgrammarand punctuation Chemistry Perio dic Tabl e o f 日ement s Co mpo und St ruct ures-val ence rul esm/zNOFC123 2*Q)确定分子离子,即确定分子量氮规则:含偶数个氮原子的奇电子离子,其质量数是偶数,含奇数个氮原子的奇电子离子,其质量数是奇数。与高质量碎片离子有合理的质量差,凡质量差在3 14和21,25之间均不可能,则说明是碎片或杂质。确定元素组成,即确定分子式或碎片化学式低分辨,利用元素的同位素丰度,元素按同位素丰度可分三大类:A;A+
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