高通量测序的应用与进展.pdf
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1、生工生物工程(上海)有限公司Sangon Biotech(Shanghai)Co.,Ltd.蒯田庖局同邈屐高通量测序服务部报告纲要 高通量测序简介 高通量测序平台的介绍 高通量测序的应用范围及案例分析 相关生物信息学分析软件介绍pANGON高通量测序简介高通量测序:一次性对,DNA分子进行并行测序,又称为下一代测序技术,其使得可对一个物种的转录组和基因组进 行深入、细致、全貌的分析,所以又被称为 深度测序。High-throughput Sequencing Next Generation Sequencing Deep S3高通量测序流程bDNA fragmentationDNA tra9t
2、aitionIn vitro adaptor ligation文库扩增In vivo clonvtg and ampkftcatjonCycle sequencingGACTAGAWCGAGCGTGA.-5(tempatei无需建立文库,两端加测序接头/PCR扩增低通量T-y-CTGATPcymerase dNTPa Labe lea ddNTPaQ ipamen-CTGATC-.CTGAICT CTGATCTA-.CTGATC7AT.CTGATC7ATG CTGATCTATGC.CTGATCATGCT 2 CTGATCWGCTC/CTGATCWGCTUGElectrophorseBtfi(1
3、 read/capii!aryGenetabon of polony arrayCyclic array sequencing(10 reada.(Brray)一 CyOe,Cycle 2 Cyoe 3Wtei ts base 17 What is case 2?WMS 拓 Hase 3?并行测序 高通量A Sang er测序B高通量测序报告纲要 高通量测序简介 高通量测序平台的介绍 高通量测序的应用范围及案例分析 相关生物信息学分析软件介绍高通量测序技术的起源与发展 1992年Lynx Therapeutics MPSS 2003年Polony Sequencing(哈佛)2005年454
4、Pyrosequencing 2006年 Solexa Sequencing-by-Synthesis 2007年 ABI SOLiD 2008年 Helicos tSMS Sequencing 2010 年Ion torrent Semiconductor Sequensing 2011 年Pacific Biosciences SMRT S6高通量测序技术的传承关系图现有主要高通量测序仪开发商测序仪品牌技术原理开发商Roche 454焦磷酸测序RocheIllumina Solexa边合成边测序IlluminaABI SOLiD基于磁珠的大规 模并行连接测序ABIHelicos单分子荧光测
5、序HelicosIon Torrent半导体测序ABISMRT单分子实时测序Pacific Bio 454 Pyrosequencing基于磁珠的焦磷酸测序:A磁珠制备设备q3cM imMt;uuiumB 454测序仪C 454测序原理Arp luatermjcihl any lucifitnn 454测序流程Load beads onto PicoTrter plateLoad enzyme beads 454测序流程与Base Calling454的特点与主要应用 读长较长,400600bp 通量较彳氐,IRunIM序歹U,400-600Mb 相对成本较高 主要应用:de novo测序 I
6、llumina Solexa简介桥式PCR边合成边测序可逆终止物Debloc k;fluor removalLibrary Preparat ion Clust er Generat ion-2 h 15 mt n hands-on(Next era)J-5 h(10 min hands-on)6 h 3 h hands-on(TruSeq)Sequenc ing by Synt hesis 1.5 t o 11 daysCASAVA2 days(30 min hands-on)ijuON Illumina Solexa 测序流程MOLECULES2.ATTACH DNA TO SURFACE
7、X BRIDGE AMPURCAT1ONOww turf ion ilng*trancidtcmptotes enchoced to the 9ubttrt.Sewral ml Bon dnM dust an of double branded DMA m g*wrted In wdi charawl th*flow csfl.Afiar UMrodtvtion.captm the Imagv of mnd flutxvMance from each duster on fho Bow caft.Record tfw idMHy of tfw flHt iorwchduataca.IMAG F
8、IRST BASE11.SEQUENCE RADS OVEA MULTFt CHEMISTRY CYCLES12.AUGN DATASMMtd chamtfy cydc to kthfarta the rant wqiMndng cyd add al four labW tvw-dbk tarmAfwtort and nynw to the floweLAfter ter evcftMion,co fy the dt b*oRpt cyciM of wqvandng to detormArt*the eqywwa of betw In Wgmem ahngie be at timetCAC1C
9、CTQ1GCCTCACTCCTG1GGGCTGATGrGCCXCCTCA GATGTGCCAC ctcactc G5;CTvCTGTGGABgn dM*.comper*to.w Illumina Solexa Base Calling Solexa的特点与主要应用读长较短,100150bp通量高,25G每天,120-150G每Run主要应用:RNA测序、表观遗传学研究 ABI SOLiD 简介 SOLiDSequencing by Oligo Ligation/Detection Olig。连接测序:通过连接酶连接,再对 olig。上荧光基团进行检测J()2B anPr mfirTTTTTri
10、ll.Adaptor Sequonco3,-I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I,Tcmplsto SoquencoS_SNV A9xyzDNmuGi :|dxfAdapter Sequence Template Sequence3(!3B山括dPrmer 2.211 1121111 山山 1111 HI I“1111111 3.Adapter Sequanco Tcmplsto SoquencsSOLiD 5500 x1ON 照ABI SOLiD测序前期制备B乳化PCR3,末端修饰C磁珠富集 转到测序玻片A样品
11、片段化 磁珠连接 ABI SOLiD测序原理1.Prime and Ligate5.Repeat steps 1-4 to Extend SequencePRIMER ROMMO 1XHWILi Option cycle567.(n cycles)6.Primer Reset2.Image3JL-3*fluo rescence 口Lein-1ta3.Cap Unextended Strands1.Me”口疗 sx:enaea sequence3A13JL133 37.Repeat steps 1-5 with new primer4.Cleave off FluorCleavage Agent
12、 v HOttTz cY primersRood Po sitio n 1 0Univorsal soq primer rr)2Universal doq primer(n-t 凭-a Urvgq 管a pr mor S-:)U W W/.q pr?mws KJn vo eqi exoo prEer mN);AA TA CCTT AT GG 2PRJMER ROUND 2Universal saq m-1 3 TTTTTTVTTTTTTT巴叫27户2930pANGON ABI SOLiD荧光结合和结果示例Possible Dinucleotides Encoded By Each Color2
13、na BaseTemplat e Sequenc eA c G T 一 G T A c A c G T AJC G T c A T G,A c G TTACGGCTADouble InterrogationWit h 2 base enc oding each base is defined t wic eA.SOLiD Olig。荧光基团模式图0SRRO29969.1 VAB_5551_12_381_F3 1ngth=35 Til.0203.3.11132110103321113023302 01+SRR029969.1 VAB_5551_12_381_F3 length=35!36!8/8
14、:!:!4 626=(8.)43),(95,B.SOLiD 测序结果示例(Color Spac e)SOLiD的特点与主要应用 读长较短,50-75bAi_ 二二 精度高,可达Q40 通量高,20-30G每天,IRun可达120G 主要应用:基因组重测序、SNP检测等三种平台的技术差异平台454So 1exaSOLiDPCR磁珠乳化PCR桥式PCR磁珠乳化PCR测序载体磁珠玻片玻片测序方式焦磷酸、荧光可逆终止物、荧光连接酶、荧光结果序列FastQFastQCSFastQ三种平台的效能参数差异平台读长通重周期精度Solexa HiSeq 2000Single-end:1 x 35 bpPaire
15、d-end:2 x 50 bpPaired-end:2 x 100 bp25 Gb/d1.5d4cl 8d50 bp 85%以上 Q30100 bp 80%以上Q30SOLiD 5500 x1Single-end:75 bp Paired-end:75 x 35 bp Mate-pair:60 x 60 bp20-30 Gb/d1d/1lane7d/12 lane7d/12 laneQ40454 GS FLX400-600 bp400-600 Mb/Run10hQ20报告纲要 高通量测序简介、高通量测序平台 高通量测序的应用范围及案例分析 相关生物信息学分析软件介绍ANGON高通量测序应用范围
16、 DNA测序、.仝基向组de novo测序 基因组重测序宏基因组测序人类外显子组捕获测序 RNA测序转录组测序小RNA测序电子表达谱测序表观基因组研究ChlP-SeqDNA甲基化测序pANGON基因组测序基因组测序是对物种的打断后进行高通量测序,根据是否有已知基因组数据主要分为de novo全基因组测序和基因组重测序。De novo基因组测序是对未知基因组序列的物种 进行基因组从头测序,利用生物信息学分析手段 对序列进行拼接、组装,从而获得该物种的基因 组图谱。全基因组重测序是对已知基因组序列的物种进行 不同个体的基因组测序,并在此基础上对个体或 群体进行差异性分析。OANGON基因组测序策略
17、Paired-EndpANGON基因组测序流程一两种测序策略Genomic DNAF rag ment(200-50 Obp)Lig at e Adapt orsSequenc e First EndReg enerat e Clust ers and Sequenc e Paired EndMat e-End Paired-end 原理100bps 100bpsGenome rearrang ement analysisChrA Genomic DNA-Correc tChrB 3KI nversion6Kt/Transloc at ionI 3KEzr二二二 3KDelet ionAmpl
18、ific at ionK 1.Paired-end基因组重排分析ANGON Paired-end和测序深度对测序效果的影响o o o o o o0 8 6 4 2S6ecs Michael James Clark,Nils Homer,Brain D.O Connor,et al.U87MG Decoded:The Genomic Sequence of a Cytogenetically Aberrant Human Cancer Cell Line.PloS Genetics,2010,6(l):el000832.3、Wei Chen,Reinhard Ullmann,Claudia La
19、ngnick,et al.Breakpoint analysis of balanced chromosome rearrangements by next-generation paired-end sequencing.European Journal of Human Genetics,2010,18:539-543.4、Van Tassell CP,Smith TP,Matukumalli LK,Taylor JF,Schnabel Rd,et al.Wholegenome sequencing and variant discovery in C.elegans.Nat Method
20、s,2008,5(2):183-188.5、Jun Wang,Wei Wang,Ruiqiang Li,et al.The diploid genome sequence of anAsian individual.Nature 456,60-65(6 November 2008)6、Huang SW,Li RQ,Wang J,et al.The Genome of the Cucumber(Cucumis sativusLinnaeus).Nature Genetics 2009;doi:10.1038/ng.475 7、David Hernandez,et al.De novo bacte
21、rial genome sequencing:Millions of veryshort reads assembled on a desktop computer.Genome Res.2008.18:802-809pANGON33基因组重测序案例分析 Erin D.Pleasance,et al.The compendium of somatic mutations in a small-cell lung cancer genome.Nature,2010,463:184-190.此研究用高通量测序对一个小细胞肺癌细胞 系NCIH209基因组进行重测序,以探讨 吸烟引发该细胞系基因组中特
22、定碱基及其周 围序列的突变及细胞损伤修复原理。a pa=B。SUOQsnEo(DqEnNAverag e c overag e(t umour and normal)3 2 10 b a EOU 6(Doual05-o(D6SUS d肺癌基因组变异情况统计图Qt 66基因组重排和CNV分析8 q w n u Ad。flChr 4从头基因组测序案例 David Hernandez,et aL De novo bacterial genome sequencing:Millions of very short reads assembled on a desktop computer.Genome
23、 Res.2008.18:802-809 止匕研究对Ship网/ococcvs aureus strain MW2Helicobacter acinonychis strain Sheeba两种细菌基因组进行从头测序,并 比较了几种拼接方法的效果。ANGON多种拼接软件拼接结果比较Table L Comparison of m於mbly result s of SSphyloetcus 010,st rain MW2 m obt ained by Ed啊 Velvet,SHARCCS,and SSAKEAssembly soft wareNo.of correct cont igs(t ot
24、al size)No.of ml$ds$embled cont igs(t ot al size)Correct cont igsNSOAverage lengt hMax lengt hTot al no.of mismat chesGenome coverageEdena st rict1122(2762 kbp)0(0 bp)6.0 kbp2.5 kbp25.7 kbp198%Edena nonst rict733(2737kbp)14(45.1 kbp)9.4 kbp17 kbp51.8 kbp9097%Velvet1093(2768 kbp)2(362 bp)5.4 kbp2.5 k
25、bp22.9 kbp26098%SSAKE2334(2782 kbp)99(85.1 kbp)2.0 kbp1.2 kbp12.6 kbp242797%SHARCGS3632(2760 kbp)3(1.5 kbp)12 kbp760 bp8.6 kbp4497%多种拼接软件拼接结果比较五种拼接方法的拼接结果比对宏基因组测序宏基因组测序是对某一特定环境,如肠道、土壤、海水等中的所有微生物进行基因组测 序。通过此方法可对该环境中的微生物种类 和优势物种进行检测,揭示微生物群落多样 性、种群结构、进化关系、功能活性、相互 协作关系及与环境之间的关系。自然环境 中很多微生物无法分离培养,而此方法无需
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