生物化学-第3章 蛋白质化学.pdf
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1、第三章蛋白质化学一、蛋白质的概念蛋白质是许多不同的a-氨基酸 按一定的序列通过肽键缩合而成的,具有较稳定的构象,并具有特定生物功能的生物大分子。二、蛋白质的化学组成(一)蛋白质的元素组成:C、H、0、N、微量的磷、铁、锌、铜、铝、碘等元素。其中氮的含量在各种蛋白质中平均为16%。每1g氮相当于6.25g的蛋白质,粗蛋白质=N%*6.25.氮的含量可用凯氏定氮法测定。其原理为:(1)消化:CH2COOH+3H2SO4(浓)-2CO2+3SO2+4H2O+NH3nh22NH3+H2so4一(NH4)2SO4(2)蒸播(NH4)2SO4+2NaOH Na2SO4=2H2O+2NH3T(3)吸收:NH
2、3+4H3B O3(过量)-NH4HB 4O7+5H2O(4)标准盐酸滴定NH4HB4O7+HCI+5H2O NH4CI+4H3B O3 r 0三聚氟胺(c3h6n6)A AH?n/、N、N%重要的氮杂环有机化工原料。简称三胺,俗称蜜胺、蛋白精三聚氧胺的含氮量为6 6.6%oQ口(-j(二)蛋白质的化合物组成7简单蛋白质结合蛋白质f a 氨基酸简单蛋白质+辅基三、蛋白质的分子大小及分类1四、蛋白质的分布和生物学功能1.酶2.结构成分(结缔组织的胶原蛋白、血管和皮肤的弹性 蛋白、膜蛋白)3.贮藏(卵清蛋白、种子蛋白)4.物质运输(血红蛋白、Na+.K+.A TPase、电子传递体等)5.细胞运动
3、(肌肉收缩的肌球蛋白、肌动蛋白)6.激素功能(胰岛素)7.接受、传递信息(受体蛋白,味觉蛋白)8.调节、控制细胞生长、分化、和遗传信息的表达(组 蛋白、阻遏蛋白)9.(抗体、皮肤的角蛋白、血凝蛋白等)第二节氨基酸一、蛋白质的水解酸水解法蛋白质的水解及水解方法Y碱水解法酶法水解酸水解法:A、稀酸水解蛋白质,得到不完全水解产物。如:蛋白陈,牛肉膏。B、浓HCI(6 mol/L)、或4moi/L硫酸于的高温下,真空条件下1024小时可将蛋白质完全水解。优点:酸水解所得的氨基酸不消旋。缺点:(1)色氨酸完全破坏。(2)丝、苏、酪氨酸,半胱氨酸小部分遭破坏。(3)天冬酰胺和谷酰胺的酰胺基被水解下来,生成
4、相应的氨 基酸和铁离子。两种酰胺的总量可直接由水解液中释放 出的氨量求出。应用:酸法水解应用广,常用于氨基酸分析中。7 Ol X)碱水解法:J,A、稀碱水解蛋白质,得到不完全水解产物。B、浓碱:常用5mol/L氢氧化钠或2mol/L氢氧化领于110。(3在真空或充氮条件下进行1020小时水解,得到完全水解产物。优点:不破坏色氨酸。缺点:多数氨基酸遭破坏。产生消旋现象。所得产物是D,LA A的 混合物。应用:常作为酸法水解的补充,测定蛋白质分子中 色氨酸的含量。J酶法水解:蛋白酶和蛋白质在适当温度、pH下保温,得到不完全水解产物。优点:条件温和,氨基酸不破坏,不消旋。(仍保持L一型。)缺点:水解
5、速度慢;因酶有专一性,常需要多种酶配合使用。水解不彻底。应用:用于蛋白质的部分水解。一级结构分析。7基酸的结构和分类(一)常见氨基酸COOHh2n-C1H1、结构通式R非解离形式coo-R两性离子形式二J2、20种氨基酸在结构上的共同特点(1)除脯氨酸以外都是a氨基酸;脯是a.亚氨基酸。(2)除了甘氨酸均有手性碳,具有旋光性。(3)除甘氨酸外,蛋白质分子中的氨基酸都是L.氨基酸。(4)不同的小氨基酸其R基侧链不同,其余部分都相同。3yo种氨基酸的结构和分类(1)按R基的化学结构分类:脂肪族、芳香族和杂环族A、脂肪族氨基酸含一氨基一竣基的中性氨基酸o-H O-CICIIH-+N 3Hc oo-c
6、 oo-+1+1h3n-c-h h3n-c-hch3 ch/h3c ch3c oo-c oo+1+Ih3n-c-h h3n-c-h-1-1-CH2 h3c-c-hCH CH2/IH3c CH3 甘氨酸(Gly5G)丙氨酸 缴氨酸 亮氨酸 异亮氨酸,(A la,A)(Val5V)(Lue5L)(lle j)、J J 含羟基或硫的脂肪族氨基酸,o H o-CICor o-CIC.)H O-CICHH o T o-CICH-C-OH I ch3ch2SH丝氨酸(Ser.S)苏氨酸(Thr,T)半胱氨酸(Cys.C)甲硫氨酸(Met,M)酸性氨基酸(两较基一氨基)及酰胺:coo-coo+I+ICH2
7、ch2COOHCOOHCOO-COO+I+CH2 ch2C CH2q xnh2 q 0 NH2天冬氨酸 谷氨酸 天冬酰胺 谷氨酰胺(A sp,D)(Glu,E)(A sn,N)(Gln,Q)杂环碱性氨基酸:or 2-。一 Hi cIc Ic 十HN+N/N HH2c Ic I c I c I c I c I N+N组氨酸(His,H)精氨酸(A rg,R)赖氨酸(Lys5K)7苯丙氨酸(Phe,F)酪氨酸(T yr,Y)色氨酸(T rg,W)C、杂环氨基酸COO+IH3N-C Hch2HC=C+/H N NH%组氨酸(H is,H)COOH2N C Hh2c ch2 xchLMF脯氨酸(Pro
8、/P)(2)根据R基团的酸碱性质分:性氨基酸、酸性氨基酸、碱性氨基酸。(3)按R基的极性分:A、非极性R基氨基酸八种:A la、Vai、Le u lie、Phe Trp、Me t Prob、不带电荷的极性R基氨基酸有七种:Se r、Thr Tyr含羟基;A sn、Gin含酰胺基;Cys 含筑基(-SH);GlyC、生理条件下带有正电荷的三种碱性氨基酸:Lys、A rg Hisd、生理条件下带有负电荷的两种酸性氨基酸:A sp GluJ分类氨基酸名称三字符号单字 符号中文 简称R基化学结构等电点丙氨酸(al an in e)Al aA丙H,c CH N HrC00H6.02缴氨酸(valine)
9、缴亮H3C CH CH-C00HNH2ch33H3C CHCH2 CH-COOH nh25.975.98非亮氨酸(leucine)氨基极异亮氨酸性(iso leucine)酸h3c ch2 lieI异亮-3 H H c cnh26.02苯丙氨酸(ph en yl al an in e)Ph eF苯丙O5.48-CH 2 CHNH2-COOH色氨酸(trypto ph an)Trpw色0|ch2 CH-COOH nh25.89H蛋氨酸(甲硫氨酸)(meth io n in e)MetM蛋(甲硫)卜hC-5.75-S CH2 CH:chnh2-cooh脯氨酸(pro l in e)ProP脯H2c
10、-1H2c(1 CN,H:h2:H COOH630分类氨基酸名称三字 符号单字 符号中文 简称R基化学结构等电点不 9 电 荷性 a 基.甘氨酸(glycine)G lyG甘H CH-COOHnh2)5.97丝氨酸(serine)SerS丝H O CH 2一CH-COOH nh25.68苏氨酸(threonine)T hrT苏H 3c CH 1 OHCH-COOH nh26.53半胱氨酸(cysteine)CysC半胱H SCH2 CH-COOH nh25.02酪氨酸(tyrosine)T yrY酪HOH3-CH2-CH-COOH nh25.66天冬酰胺(asparagine)AsniN天酰0
11、II _H2N-CCH2-CH-COOH叫5.41谷氨酰胺(glutamine)G inQ谷酰0II _H2N C CH2-CH 2 p-COOH N H z5.65带正电荷极性氨基酸组氨酸(histidine)赖氨酸(lysine)精氨酸(arginine)R组赖HCHI NZCHI N+H7.5974%极性氨基酸 带负电荷天冬氨酸(aspartic acid)谷氨酸(glutamic acid)E精W世-2)NHCH-COOH nh210.76天冬-OOC-CH2-CH-COOH nh22.97省ooc-ch2-ch2-CH-COOHNH2 一3.22二十考儿命质AdkA-畲类据R基团极性
12、分类据R基团化 学结构分类非极性R基团氨基酸(8种)不带电荷(7种)极性R基团氨基酸脂肪族氨基酸带电荷芳香族氨基酸(Phe、T yr、T rp)杂环氨基酸(H is、Pro T rp)带正电荷(3种)带负电荷(2种)据营养学 分类据氨基、竣基数分类必需氨基酸非必需氨基酸一氨基一竣基氨基酸人体必需氨基酸Lys Vai liept r r eh TMTe u n eArg、H is二氨基一竣基氨基酸(Lys、H is、Arg)一氨基二竣基氨基酸(G lu、Asp)KJ(二)蛋白质中的稀有氨基酸OH;H-巧C耳2H.,C5 2CH-COOH n/14羟基脯氨酸6 5 4,h2n-ch2-ch-ch2
13、-ch.OH 5.羟基赖氨酸z ICH凡 1HOOC U/NHzCH(CH 心-VV-(CH2)t CHh/6%;Xc00H(CH 1 1CH/HaN COOH 缚%Jnnn 锁链素:由4个赖氨酸TUUH形成的衍生物。4.1)*CHlCHT00HHjNCHj-CHj-CHj-OOOH出基TRHAC-NH-CHlCElCHHJHCOOHos E NaCElCHlCHlC3HoOH Ir-三、氨基酸的理化性质(一)一般的物理性质1、晶体形状2、熔点3、味感4、溶解度5、旋光性6、紫外吸收性质7)(二氨基酸的两性解离及等电点1、氨基酸是两性化合物,在晶体或水溶液中以兼性 离子形式存在。-H Rif
14、CN2HR j“+I COOH H3NCHCOO-广义的酸碱概念:HA 12.5时,氨基酸分子中所有可解离的基团全部去质子化,分子带负电荷。NH2R-CH-COO-(3)当环境pH处于1.7和12.5之间时,氨基酸的解离 状况和带电性质会随氨基酸种类不同发生很大变化。等电点:当氨基酸溶液在某一pH时,氨基酸分子所带正 负电荷相等,成为两性离子,在电场中既不向阳极 也不向阴极移动,此时溶液的pH即为该氨基酸的等 电点(pl)。等电点时,氨基酸的溶解度最小小结引入等电点概念之后,A A的解离情况与环境PH的关系 可以描述为:A、当环境PH=PI时氨基酸以两性离子形式存在。B、当环境PHVPI时(相
15、当于加入了H+)氨基酸带正电 荷,环境PH偏离等电点越远,氨基酸带正电荷越多;电泳时移向负极。C、当环境PHA PI时(相当于加入了OK)氨基酸带负电 荷,环境PH偏离等电点越远,氨基酸带负电荷越多;电泳时移向正极。3、等电点与氨基酸分子两性解离基团的解离平 衡常数的关系(1)中性氨基酸的解离一氨基一按基A A的 等电点计算:Pl=pKi+pK22(2)碱性氨基酸的解离二氨基一竣基A A的 等电点计算:2(3)酸性氨基酸的解离COOHI CH-NH;ch2COOHOH-H*COT I I CH-NH;卜 COOHAsp1K,coo-Oir I 2 CH-NH;H+|)CH2 iIco(rA即C
16、OO-Offch-nh2COO-pKi+pK2一氨基二竣基A A的 _等电点计算:2结论:氨基酸的Pl值等于该氨基酸的两性离子状态两侧的 基团P。值之和的二分之一。例题:某氨基酸溶于pH7的水中,所得氨基酸溶液的pH为8,问此氨基 酸的pl是大于8、等于8还是小于8?解析:主要从氨基酸的解离特点考虑,先确定其两性离子状态(即等电点状态),然后分析氨基酸溶液变为8时是从水中吸 收了质子还是释放了质子。解答:氨基酸晶体主要以两性离子形式存在,溶于PH7的水中,溶液的pH从7升为8,说明氨基酸在溶解的过程中从水中吸收 了质子。溶液中有如下平衡:A A 土+H20.A A+0H-所以,要使A A+所带
17、电荷为零,必须加碱,这会使pH8,故氨基酸的pl 8oy4、HA NDERSON-HA SSELB A LCH(汉哈二氏公式)质子受体pH二pK,+lg-质子供体应用:(1)已知各离子浓度,求溶液的pH值。(2)根据氨基酸解离基团的pK值,可计算出任何pH 条件下,各离子浓度的比例。例题1:计算赖氨酸的-NH3+20%被解离时 的溶液pH值。解:首先写出解离方程COOH&C00%C00-二 0七 .0M ICHNH3 CH-NH3 CHNHI 田 ir(ch2)4(ch2)4(ch2)4I I;I4NH3 4NH3Lys+Lys+Lys土根据:pK3=10.53 pH=pK+lg20%岛 OK
18、 i=z H4COO-I CH-NH2NH,Lys质子受体质子供体所以:pH=10.53+|g-7 0%=9.9例题2:计算A sp的B-COOH三分之二被解离时的溶液pH。解:写出解离方程COOHI CHNH;OH-H*COOHA sp十co(rI I ICHCH2 I COOHk2 coo-oir I g CH-NH;H4|CH2 I co(rA sp1&coo-3 IOHCHNH)H*|2CH.iCOO-A sp*质子受体pK2=3.86 根据:所以:pH=3.86+lgpH=pK+lg2/3-=4 21/3.质子供体5、氨基酸的PH缓冲作用当环境pH在接近氨 基酸的任一解离基 团的pK
19、a附近时,氨基酸对外来的酸 碱(pH)具有缓 冲作用。将1 mol甘氨酸溶于 水,溶液的pH约等 于6,此时甘氨酸以 兼性离子形式存在。A:用标准盐酸滴定B:用标准NaOH滴定H2.34和pH9.6 0处,Gly具有缓冲能力。起点:100%Gly+净电荷:+1 第一拐点:50%Gly+,50%Gly 平均净电荷:+0.5pH=pK+lg Gly /Gly+=pKl=2.34第二拐点:100%Gly土净电荷:0等电点pl第三拐点:50%Gly,50%Gly-平均净电荷:05pH=pK2+lg Gly-/Gly =pK2=9.6终点:100%Gly-净电荷:-13)pHOH-(摩尔浓度)H2NCH
20、OCHH 2一1 CICICICnnncH+吁粤H xc/HN+NHCOOHH H10pH 68420 1.6 2.0 3.0OH一(摩尔浓度)(b)例题1:下列氨基酸在生理pH范围内缓冲容量最大的 氨基酸是()(1)Gly(2)His(3)A sp(4)Trp例题2:Glu(pKi a-COOH 2.19,pK2 a-NH3+9.6 7,pKR R-COOH 4.25,pl 3.22)写出解离方程指出Glu-和Glu二各一半时的pH值指出Glu总是带正电荷的pH范围指出Glu土和Glir能作为缓冲液使用的pH范围解离方程:Glu-和Glu=各50%时pH为9.67pH H+Q+cooHCHO
21、 I_ _ ch2IN(CH2OH)2cooch2nh2cooI ch2Inhch2oh用标准NaOH滴定氨基酸甲醛滴定法:根据标准NaOH的消耗量计算出样 品溶液中a 氨基酸的浓度。应用:判断蛋白质水解或合成的进度7 vMH.JJ,4二硝基氟苯(DNFB)的反应R弱OH-02N/F r NO,H2NCH-COOHRO2NNH-CH COOH+HFNO,2,4.二硝基苯氨基酸,黄色(简写DNP.氨基酸,可用乙酸抽提)多肽或蛋白质N端氨基酸的a 氨基也能与DNFB 反应,生成DNP多肽或DNP蛋白质。具体的应用步骤简述如下:A、多肽链的ccN”与DNFB反应,生成DNP 多肽链。B、酸法完全水解
22、产生各种氨基酸和黄色的DNP 氨基酸。C、利用DNP氨基酸在有机溶剂中的溶解度与其它氨基 酸不同,可以用乙醛把DNP氨基酸抽提出来。CL X)D、所得DNP-氨基酸经纸层析,从纸层析图谱上的黄色斑 点位置可鉴定N-端氨基酸的种类。I:NH-保护热 NH保护基这个反应使氨基酸的竣基活化合成多肽 口(3)脱竣酶催化的脱竣反应、J3、A-NR2和A-COOH共同参与的反应(1)、成肽反应R1 0 R2 Ri:0:R2I III-I-h2o.H2N-C-C-OH+HNcCOOH-邸丁 c-COOHI-|H H H H:H:H肽键肽及肽键的概念:二肽、三肽多肽。短肽的命名:如甘氨酰丙氨酸丙氨酰甘氨酸)与
23、黄三酮的反应+HQ年三酮水合荀三酮+RCHCOOH水合苛三酮(无色)NH200/yV0还原性年三酮HOH脯氨酸和羟脯氨酸与黄三酮反应产生黄色物质,其余 所有的a-氨基酸与黄三酮反应均生蓝紫色物质。H,CCH,h、j&-cooh tT H4、个别R基团参与的反应7(1)筑基(-SH)的性质a氧化还原反应可使蛋白质分子中二硫键形成或断裂oooc chch2 nh3+ooc chch2 nh3+SH 00CCH-CH2氧化 ih3+sr I还原 sSH 00Cch-ch2b过甲酸的作用下,-SH或二硫键被氧化成磺酸基 _C-SH易与碘乙酸反应形成稳定的烷基衍生物(2)个别R基团参与的颜色反应反应基团
24、反应试剂及现象苯环(苯丙、色、酪)与浓硝酸黄色反应酚羟基(酪)吗I噪基(色)脏基(精)与福林酚蓝色反应 与重氮化合物橘黄色反应 与硝酸汞、硝酸红色反应 与乙醛酸及硫酸紫红色反应 碱性,与a蔡酚和次滨酸盐 红色反应四、氨基酸的分离、分析和鉴定 层析一也叫色层分析,又叫色谱 满足四个基本条件:1、水不溶性惰性支持物2、流动相(溶剂系统)3、固定相4、样品混合物的分配系数不同怅循才局则/b理居忻注吊力力:分配层析(基于溶解度不同)纸层析,薄层层析 离子交换层析(基于电荷性质不同)分子筛过滤层析(基于分子大小不同)亲和层析(基于亲和力不同)高效液相色谱(HPLC):是一种快速、灵敏的分离生物分子的方法
25、。与常规的 层析法相比,HPLC采用的介质颗粒细,表面积大,这样的 介质极大地提高了分辨率。但由于颗粒过细,又会增加流 动阻力,使洗脱速度减慢。因此需要对溶剂系统采用较高的压力,以有效增加洗脱速度。(一)分配层析-以纸层析为例介绍1、原理 溶质在流动相中的溶解度分配系数二-溶质在固定相中的溶解度2、操作步骤:辨滤纸纹方向铅笔划线作标记毛细管点样(0.2-0.3cm)卷筒,展层等计算:Rf=-Y31展层剂的种类中性展层剂:正丁醇+水(或苯酚+水)一用于单向层析 碱性展层剂:正丁醇:12%股4。氏95%乙醇=13:3:3 酸性展层剂:正丁醇:80%甲酸:水=15:3:2(后两种常用于双向层析-P8
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