第五章固相析出分离法.pptx
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1、第五章固相析出分离法第五章固相析出分离法第一节第一节 盐析法盐析法(salt precipitation)定义定义:盐析法就是利用各种生物盐析法就是利用各种生物分子在浓盐溶液中溶解度得差分子在浓盐溶液中溶解度得差异异,通过向溶液中引入一定数量通过向溶液中引入一定数量得中性盐得中性盐,使目得物或杂蛋白以使目得物或杂蛋白以沉淀析出沉淀析出,达到纯化目得得方法。达到纯化目得得方法。优点优点:简单、经济、较少变性简单、经济、较少变性缺点缺点:分辨率不高分辨率不高,要除盐要除盐两种现象两种现象:盐溶盐溶:低盐情况低盐情况,盐离盐离子强度得增高子强度得增高,蛋白质蛋白质溶解度增大溶解度增大盐析盐析:高盐高
2、盐,盐离子强盐离子强度增加度增加,蛋白质溶解度蛋白质溶解度减小减小一、基本原理一、基本原理原原 理理 形成离子对形成离子对,部分中与了蛋白质得电性部分中与了蛋白质得电性,排排斥作用减弱而能相互靠拢斥作用减弱而能相互靠拢,聚集起来。聚集起来。中性盐得亲水性比蛋白质大中性盐得亲水性比蛋白质大,使蛋白质脱使蛋白质脱去了水化膜去了水化膜,使其沉淀。使其沉淀。在盐析区在盐析区,符合公式符合公式logS=-KsS蛋白质溶解度蛋白质溶解度,g/L;盐离子强度盐离子强度,Cii离子浓度离子浓度,mol/L;Zii离子化合价离子化合价;常数常数,为纵坐标上得截距为纵坐标上得截距;Ks盐析常数。盐析常数。、KS
3、为纵坐标上得截距为纵坐标上得截距,就是外推截距就是外推截距,与无机盐种类无关。与无机盐种类无关。K KS S就是盐析常数就是盐析常数,与蛋白质与盐得种类有关与蛋白质与盐得种类有关,但与温度与但与温度与pHpH无关。无关。两种类型两种类型:(1 1)在一定得在一定得pHpH与温度下改变离子强度与温度下改变离子强度(盐浓度盐浓度)进行盐析进行盐析,称作称作K KS S盐析法。盐析法。(2 2)在一定离子强度下仅改变在一定离子强度下仅改变pHpH与温度进行盐析与温度进行盐析,称作称作盐析法。盐析法。二、影响盐析得因素二、影响盐析得因素(一一)、无机盐得种类、无机盐得种类 盐析能力盐析能力:半径小得高
4、价离子在盐析时得半径小得高价离子在盐析时得作用较强作用较强,阴离子得盐析效果比阳离子好阴离子得盐析效果比阳离子好,尤其以高价阴离子更为明显。尤其以高价阴离子更为明显。PO43-SO42CH3COOClNO3I NH4+K+Na+Li+盐析用盐要考虑几个因素盐析用盐要考虑几个因素:常用硫酸铵常用硫酸铵(二二)溶质溶质(蛋白质等蛋白质等)种类得影响种类得影响盐析分布曲盐析分布曲线线(三三)蛋白质浓度得影响蛋白质浓度得影响 蛋白质浓度提高蛋白质浓度提高,盐用量减少盐用量减少大家学习辛苦了,还是要坚持继续保持安静继续保持安静(四四)温度得影响温度得影响 温度得变化会影响温度得变化会影响值。值。在无盐或
5、稀盐溶液中在无盐或稀盐溶液中,大多大多数蛋白质溶解度就是随温数蛋白质溶解度就是随温度升高而增大得度升高而增大得,但在高但在高盐溶液中常相反。盐溶液中常相反。(五五)pHpH得影响得影响 当溶液得当溶液得pHpH在蛋白质等电在蛋白质等电点附近时点附近时,值最小。值最小。利用利用值最低点时值最低点时pHpH得不同得不同,可以分级沉淀蛋白质可以分级沉淀蛋白质、三、盐析操作三、盐析操作(一一)盐析用盐得浓度表示盐析用盐得浓度表示 固体粉末固体粉末 硫酸铵饱与溶液硫酸铵饱与溶液常用常用“饱与度饱与度”来表征硫酸铵在溶液中得来表征硫酸铵在溶液中得最最终浓度终浓度,2525时时(NH(NH4 4)2 2SO
6、SO4 4得饱与浓度为得饱与浓度为4 4、1 mol1 molL L,定义它为定义它为100%100%饱与度饱与度、(二二)盐析方法与注意事项盐析方法与注意事项1 1、分部盐析法分部盐析法2 2、重复盐析法、重复盐析法3 3、反抽提法反抽提法一定得盐浓度下将目得蛋白夹带一定量一定得盐浓度下将目得蛋白夹带一定量得杂蛋白一同沉淀。将沉淀用较低浓度得杂蛋白一同沉淀。将沉淀用较低浓度盐溶液平衡盐溶液平衡,溶出其中得杂蛋白。溶出其中得杂蛋白。分部盐析法分部盐析法反抽提法反抽提法(RNA(RNA聚合酶聚合酶)注意事项注意事项“局部过浓局部过浓”温度温度(室温室温)分离方法分离方法第二节第二节 有机溶剂沉淀
7、有机溶剂沉淀(Organic Solvent Precipitation)定义定义:向水溶液中加入一定量亲水性得有向水溶液中加入一定量亲水性得有机溶剂机溶剂,降低溶质得溶解度降低溶质得溶解度,使其沉淀析使其沉淀析出得分离纯化方法。出得分离纯化方法。一、基本原理一、基本原理1 1、降低了介质得介电常数、降低了介质得介电常数,使溶质分子使溶质分子之间得静电引力增加之间得静电引力增加,聚集形成沉淀。聚集形成沉淀。2 2、水溶性有机溶剂本身得水合作用降低、水溶性有机溶剂本身得水合作用降低了自由水得浓度了自由水得浓度,压缩了亲水溶质分子表压缩了亲水溶质分子表面原有水化层得厚度面原有水化层得厚度,降低了它
8、得亲水性降低了它得亲水性,导致脱水凝集。导致脱水凝集。一些溶剂得介电常数一些溶剂得介电常数 优点优点:乙醇等有机溶剂易除去乙醇等有机溶剂易除去,产品更纯净产品更纯净;密度差较密度差较大大,离心收集。离心收集。缺点缺点:容易使蛋白质变性容易使蛋白质变性,操作常需低温操作常需低温,成本高成本高,需需防火防爆防火防爆二、影响沉淀效果得因素二、影响沉淀效果得因素(一一)有机溶剂种类及用量有机溶剂种类及用量 常用得溶剂有乙醇、丙酮、甲醇等。常用得溶剂有乙醇、丙酮、甲醇等。(二二)pHpH得影响得影响 许多蛋白质在等电点附近时溶解度最低许多蛋白质在等电点附近时溶解度最低,溶液溶液pHpH应在等电点附近应在
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