PCR实验室的基本设备与要求.doc
《PCR实验室的基本设备与要求.doc》由会员分享,可在线阅读,更多相关《PCR实验室的基本设备与要求.doc(17页珍藏版)》请在咨信网上搜索。
1、PCR实验室的基本设备与要求临床基因扩增检验实验室管理暂行办法第一章 总 则第一条 为规范临床基因扩增检验实验室管理,保证临床基因扩增检验质量,使临床诊断和治疗更为科学、合理,特制定本办法。第二条 临床基因扩增检验技术指以临床诊断治疗为目的,以扩增检测DNA或RNA为方法的检测技术,如聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、转录依赖的放大系统(TAS)自主序列复制系统(3SR)和链替代扩增(SDA)等。第三条 本办法适用于开展临床基因扩增检验的实验室。临床基因扩增检验实验室设立在二级以上医院。第四条 临床基因扩增检验实验室必须使用经国家药品监督管理局批准的临床检验试剂开展临床基因扩增检
2、验项目。第五条 卫生部临床检验中心(以下简称卫生部临检中心)和省、自治区、直辖市临床检验中心(以下简称省临检中心)负责对所辖行政区域内临床基因扩增检验实验室的质量监督管理工作。第二章 实验室设置和验收第六条 拟设置临床基因扩增检验实验室的医疗机构按照临床基因扩增检验实验室基本设置标准(见附件)筹建实验室;筹建完成后,由法定代表人向卫生部临检中心提出技术验收申请。申请时需提交以下材料:(一)医疗机构执业许可证复印件;(二)可行性研究报告;1、 拟设临床基因扩增检验实验室机构的所在地医疗卫生资源状况、本机构的基本情况、对临床基因扩增检验的需求以及临床基因扩增实验室运行的预测分析;2、 拟设临床基因
3、扩增检验实验室的设置平面图;3、 拟设临床基因扩增检验实验室将开展的检验项目、实验设备条件和有关技术人员资料第七条 卫生部临检中心和省临检中心共同组织相关专业的专家组(以下简称专家组),按照临床基因扩增检验实验室基本设置标准对提出申请的临床基因扩增检验实验室进行技术验收。验收完成后,在20日内将验收报告寄送至申请机构。第八条 经专家组技术验收合格的医疗机构将本办法第六条规定的材料及专家组验收报告送至省级行政部备案。在将符合规定的全部材料送达省级卫生行政部门后15日内未收到省级卫生行政部门不同意的意见,方可开展专家组技术验收合格的临床基因扩增检验项目。第九条 未经专家组验收合格并报省级卫生行政部
4、门备案的医疗机构不得擅自开展临床基因扩增检验项目。第三章 实验室监督管理第十条 临床基因检验实验室必须按照临床基因扩增检验实验室工作规范(另发)开展临床基因扩增检验工作。第十一条 临床基因扩增检验实验室技术人员必须进行上岗培训。经培训合格者,由培训单位发给合格证书,并将培训合格人员名单报卫生部临检中心备案。获得培训合格证书者方可从事临床基因扩增检验工作。培训单位为卫生部临检中心,或由省级卫生行政部门指定并经卫生部临检中心认定的机构。培训时使用规定的统一教材。第十二条 以科研为目的的基因扩增检验项目。不得向临床出具检验报告,不得向病人收取任何费用。第十三条 临床基因扩增检验实验室必须按照临床基因
5、扩增实验室工作规范开展室内质量控制,并参加卫生部临检中心组织的室内质量评价。第十四条 卫生部临检中心按照本方法和临床基因扩增实验室工作规范协调、组织省临检中心对临床基因扩增检验实验室的检验质量进行监测。监测结果报省级卫生行政部门,同时抄送被监测的临床基因扩增检验实验室所在医疗机构。第十五条 卫生部临检中心或省级临检中心受省级以上卫生行政部门委托可对临床基因扩增检验实验室进行现场检查,现场检查工作人员在履行职责时应出示证件。在进行现场检查时,检查人员有权调阅有关资料,被检查机构不得拒绝或隐瞒。第十六条 卫生部临检中心对在室间质量评价中不合格的临床基因扩增检验实验室提出警告,对连续二次或三次中有二
6、次发现临床基因扩增检验结果不合格的临床基因扩增检验实验室,卫生部临检中心报省级以上卫生行政部门由省级以上卫生行政部门责令其暂停有关临床基因扩增检验项目,限期整改。经专家组进行再次技术验收并合格,并报省级卫生行政部门核准后,方可重新开展临床基因扩增检验项目。第十七条 对于未经卫生部临检中心组织的专家组技术验收合格并报省级卫生部门备案,擅自开展临床基因检验项目的医疗机构,由省级卫生行政部门依据医疗机构管理条例第四十七条和医疗机构管理条例实施细则第八十条予以处罚,并予以公告。公告所需费用由被公告机构支付。第十八条 出现下列情况之一的临床基因扩增检验实验室,由省级卫生行政部门责令其停止开展临床基因扩增
7、检验,并对其所在医疗机构予以公告。公告所需费用由被公告机构支付:(一) 开展超出卫生部临检中心组织的技术验收合格并报省级卫生行政部门备案 临床基因扩增检验项目的;(二) 使用未经国家药品监督管理局批准的试剂开展临床基因扩增检验的;(三) 在临床基因扩增检验中未开展室内质量控制的;(四) 在临床基因扩增检验中未参加室间质量评价的;(五) 在临床基因扩增检验中弄虚作假的;(六) 以科研为目的的基因扩增检验项目向病人收取费用的;(七) 使用未经培训合格的专业技术人员从事临床基因扩增检验的;第四章 附 则第十九条 对采供血机构的基因扩增检验实验室开展基因扩增检验项目的管理,参照本办法执行。第二十条 卫
8、生部临检中心组织的专家组对申请开展临床基因扩增检验的实验室进行技术验收所需费用按国家有关规定执行。第二十一条 本办法由卫生部负责解释。第二十二条 本办法自发布之日起施行。附:临床基因扩增检验实验室基本设置标准根据临床检验扩增检验实验室管理暂行办法,制定本标准一、 临床基因扩增检验实验室区域设置原则(一) 临床基因扩增检验实验室区域设置原则1、 试剂储存和准备区2、 标本制备区3、 扩增反应混合物配制和扩增区4、 扩增产物分析区如使用全自动分析仪,区域可适当合并。(二) 各工作区域必须有明确的标记,避免不同工作区域内的设备、物品混用。(三) 进入各工作区域必须严格按照单一方向进行,即试剂储存和准
9、备区 标本制备区扩增反应混合物配制和扩增区扩增产物分析区。(四) 不同的工作区域使用不同的工作服(例如不同的颜色)。工作人员离开各工作区域时,不得将工作服带出。二、 工作区域仪器设备配置标准(一) 试剂储存和准备区1、2-8C和-15C冰箱2、混匀器3、微量加样器(覆盖1-1000ul)4、移动紫外灯(近工作台面)5、消耗品:一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤心)6、专用工作服和工作鞋7、专用办公用品(二) 标本制备区1、2-8C冰箱、-20C或-80C冰箱2、高速台式冷冻离心机3、混允器4、水浴箱或加热模块5、微量加样器(覆盖1-1000ul)6、可移动紫外灯(近
10、工作台面)7、超净工作台8、消耗品:一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤心)9、专用工作服和工作鞋10、专用办公用品如需处理大分子DNA,应具有超声波水浴仪。(三) 扩增反应混合物配制和扩增区1、 核酸扩增仪2、 微量加样器(覆盖1-1000ul)3、 可移动紫外灯(近工作台面)4、 消耗品:一次性手套、一次性吸水纸、耐高压处理的离心管和加样器吸头(带滤心)5、 专用工作服和工作鞋6、 专用办公用品(四)扩增产物分析区视检验方法不同而定。基本仪器设备如下:1、 微量加样器(覆盖1-1000ul)2、 可移动紫外灯(近工作台面)3、 消耗品:一次性手套、一次性吸水纸、加
11、样器吸头(带滤心)4、 专用工作服和工作鞋5、 专用办公用品临床基因扩增检验实验室工作规范为使基因扩增检验技术有效地应用于临床,更好地为疾病的预防、诊断和治疗服务,保证检验质量,特制定本规范。 一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置及其管理 临床基因扩增检验实验室的规范化设置详见临床基因扩增检验实验室管理暂行办法(卫医发200210号文)附件临床基因扩增检验实验室基本设置标准。为避免污染,必须严格遵循临床基因扩增检验实验室设置标准设置临床基因扩增检验实验室。临床基因扩增检验实验室四个隔开的工作区域中每一区域都须有专用的仪器设备。各区域都必须有明确的标记,以避免设备物品如加样器或试剂等从其各自的
12、区域内移出从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆。进入各个工作区域必须严格遵循单一方向顺序,即只能从试剂贮存和准备区、标本制备区、扩增反应混合物配制和扩增区(简称扩增区)至产物分析区,避免发生交叉污染。在不同的工作区域应使用不同颜色或有明显区别标志的工作服,以便于鉴别。此外,当工作者离开工作区时,不得将各区特定的工作服带出。清洁方法不当也是污染发生的一个主要原因,因此实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。(一)试剂贮存和准备区 下述操作在该区进行:贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。贮存试剂和用于标本制备的材
13、料应直接运送至试剂贮存和准备区,不能经过产物分析区。在打开含有反应混合液的离心管或试管前,应将其快速离心数秒。试剂原材料必须贮存在本区内,并在本区内制备成所需的贮存试剂。当贮存试剂溶液经检查可用后,应将其分装贮存备用,避免由于经常打开反应管吸液而造成污染。含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应快速离心数秒。大多数用于扩增的试剂都应冰冻贮存。为避免因单次反应取液而频繁的冻融主贮存试剂,应分装冰冻贮存试剂溶液。贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定。主反应混合液的组成成份尤其是聚合酶的适用性和稳定性通过预试验来检查,评价结果必须有书面报告。对于热启动技术(在第一个高温变
14、性步骤后加入酶),聚合酶也可不包含在主反应混合液中。在整个本区的实验操作过程中,操作者必须戴手套,并经常更换。此外,操作中使用一次性帽子也是一个有效地防止污染的措施。严禁用嘴吸取液体,加样器和吸头等必须经高压处理。工作结束后必须立即对工作区进行清洁。本工作区的实验台表面应可耐受诸如次氯酸钠的化学物质的消毒清洁作用。实验台表面的紫外照射应方便有效。由于紫外照射的距离和能量对去污染的效果非常关键,因此可使用可移动紫外灯(254nm波长),在工作完成后调至实验台上6090cm内照射。由于扩增产物仅几百bp,对紫外线损伤不敏感,因此紫外照射扩增片段必须延长照射时间,最好是照射过夜。实验室及其设备的使用
15、必须有日常记录。(二)标本制备区 下述操作在该区进行:临床标本的保存,核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。要正确使用加样器。由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染,所以应避免在本区内不必要的走动。可通过在本区内设立正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。为避免样本间的交叉污染,加入待测核酸后,必须盖好含反应混合液的反应管。对具有潜在传染危险性的材料,必须有明确的样本处理和灭活程序。用过的加样器吸头必须放入专门的消毒(例如含次氯酸钠溶液)容器内。实验室桌椅表面每次工作后都要清洁,实验材料(原始血标本、血清标本、提取中的标本与试剂的混合液等)如出
16、现外溅,则必须分别处理并作出记录。对实验台适当的紫外照射(254nm波长,与工作台面近距离)适合于灭活去污染。可移动紫外线管灯可用来确保工作后对实验台面的充分照射。样本处理对核酸扩增有很大影响,必须使用有效的核酸提取方法,可在开展临床标本检测前对提取方法进行评价。用于RNA扩增检测的样本制备好以后,应立即进行cDNA合成,因为cDNA链较RNA稳定,保存相对容易。为保证逆转录反应的需要,应在标本制备区设置一个以上的温育装置。cDNA合成的理想温度依所使用的酶而定,倾向于使用一步法:即使用在扩增反应缓冲液条件下具有逆转录活性的热稳定的DNA聚合酶进行逆转录,其较cDNA合成后再开盖以调节缓冲液或
17、加入聚合酶进行扩增发生污染的可能性降低。待测RNA的cDNA拷贝须保存在标本制备区,不得在本区对样本进行PCR扩增。(三)扩增区 下述工作在本区内进行:DNA或cDNA扩增。此外,已制备的DNA模板和合成的cDNA(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式PCR测定中,通常在第一轮扩增后必须打开反应管,因此巢式扩增有较高的污染危险性,第二次加样必须在本区内进行。不能从本区再进入任何上游区域,可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污染,应尽量减少在本区内的走动。如有加样则应在超净台内进行。打开预处理过的反应混合液时
18、必须防止液体溅出,尤其是在巢式扩增步骤之间。一个简单的方法是在打开反应管前快速离心数秒。可使用体积较小的离心机,因其所占实验台面小,易于用一只手操作,适合于大多数超净台。防潮屏障如石蜡油或轻矿物油也具有防污染作用,但必须注意的是,矿物油本身也可能成为一种持续性的污染源。用过的加样器必须注意清洁消毒。完成操作及每天工作后都必须对实验室台面进行清洁和消毒,紫外照射方法与前面区域相同。如有溶液溅出,必须处理并作出记录。(四)扩增产物分析区 下述操作在本区内进行:扩增片段的测定。核酸扩增后产物的分析方法多种多样,如膜上或微孔板上探针杂交方法(同位素标记或非同位素标记)、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电
19、泳、Southern转移、核酸测序方法等。目前国内的商品试剂盒绝大部分均采用非同位素标记的微孔板上探针杂交方法,即PCR-ELISA方法,也有膜上探针杂交方法。本区是最主要的扩增产物污染来源,因此必须注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。在使用PCR-ELISA方法检测扩增产物时,必须使用洗板机洗板,废液必须收集至1mol/L HC1中,并且不能在实验室内倾倒,而应至远离PCR实验室的地方弃掉。用过的吸头也必须放至1mol/L HCl中浸泡后再放到垃圾袋中按程序处理,如焚烧。由于本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或同位素等,故应注意实验人员的安全防护。
20、本区的清洁消毒和紫外照射方法同前面区域。本区如采用负压条件或减压情况下(如安装排风扇)可减少扩增产物从本区扩散至前面区域的可能性。二、临床基因扩增检验实验室质量保证 临床基因扩增检验实验室质量保证涉及到整个基因扩增检验的所有阶段,即测定分析前的标本采集处理、测定中的核酸提取、扩增和产物分析以及测定后的结果报告等。(一)标本的采集 常用于基因扩增检测的临床标本包括EDTA或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。采血液等样本时,应使用一次性密闭容器,如真空采血管。当使用非密闭采样系统时,如尿、分泌物和骨髓的采样,必须注意防止来自采样者的皮屑或分泌物的污染。采样时必须戴一次性
21、手套。玻璃器皿在使用前应高压处理,因为玻璃器皿常含有不易失活的RNA酶。最好是热灭菌,250烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。全血和骨髓标本必须进行抗凝处理。EDTA和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝,因为肝素是Taq酶的强抑制剂,而且在其后的核酸提取步骤中很难去除。临床用于RNA(如HCV RNA)扩增检测的血标本建议进行抗凝处理,并尽快(3小时以内)分离血浆,以避免RNA的降解。如未作抗凝处理,则抽血后,必须在1小时内分离血清。(二)标本的稳定化处理 用于DNA扩增检测的标本,采集后一般不需要特殊的稳定化处理,但标本应及时送至实验室。由于RNA易受RNA酶的降解,因此用于RNA
22、测定的标本有时必须进行稳定化处理,如流行病学调查的现场采样。异硫氰酸胍盐(Guanidine thiocyanate,GITC)可使DNA酶和RNA酶立即失活,因此在采集标本时,可将标本材料如血清或血浆按1:4的比例加至含有5mol/L GITC的试管中,从而使血清(浆)中的RNA酶不可逆失活。经上述稳定化处理后,标本一般不需要冷藏即可邮寄。对于特定的检测项目,上述稳定化处理方法的效果究竟如何,要使用相应的逆转录PCR测定方法来评价。(三)标本的运送 标本采集后必须尽快送至实验室。经过适当稳定化处理的标本可在常温下通过邮寄运送。如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血标本及用于RNA扩增检测的经
23、GITC稳定化处理的标本。通常在运送时,应采用不易破碎的容器装载标本。用于RNA检测的标本,如果未经稳定化处理,则必须速冻后,放在干冰中运送。(四)标本的贮存 临床体液标本如血清/血浆等可于-70下长时间贮存。用于DNA测定的已纯化核酸样本可在10mmol/L Tris-1 mmol/L EDTA缓冲液(pH 7.5-8.0)中4保存。用于RNA测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中-80或液氮中贮存。用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20即可。用GITC处理的RNA标本在室温可保存7天。(五)标本的处理(核酸提取) 标本处理即核酸提取纯化是决定扩增检测成败的关键性步骤,在使用商品核酸提取试剂提取临床标本
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- PCR 实验室 基本 设备 要求
1、咨信平台为文档C2C交易模式,即用户上传的文档直接被用户下载,收益归上传人(含作者)所有;本站仅是提供信息存储空间和展示预览,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容不做任何修改或编辑。所展示的作品文档包括内容和图片全部来源于网络用户和作者上传投稿,我们不确定上传用户享有完全著作权,根据《信息网络传播权保护条例》,如果侵犯了您的版权、权益或隐私,请联系我们,核实后会尽快下架及时删除,并可随时和客服了解处理情况,尊重保护知识产权我们共同努力。
2、文档的总页数、文档格式和文档大小以系统显示为准(内容中显示的页数不一定正确),网站客服只以系统显示的页数、文件格式、文档大小作为仲裁依据,平台无法对文档的真实性、完整性、权威性、准确性、专业性及其观点立场做任何保证或承诺,下载前须认真查看,确认无误后再购买,务必慎重购买;若有违法违纪将进行移交司法处理,若涉侵权平台将进行基本处罚并下架。
3、本站所有内容均由用户上传,付费前请自行鉴别,如您付费,意味着您已接受本站规则且自行承担风险,本站不进行额外附加服务,虚拟产品一经售出概不退款(未进行购买下载可退充值款),文档一经付费(服务费)、不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。
4、如你看到网页展示的文档有www.zixin.com.cn水印,是因预览和防盗链等技术需要对页面进行转换压缩成图而已,我们并不对上传的文档进行任何编辑或修改,文档下载后都不会有水印标识(原文档上传前个别存留的除外),下载后原文更清晰;试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓;PPT和DOC文档可被视为“模板”,允许上传人保留章节、目录结构的情况下删减部份的内容;PDF文档不管是原文档转换或图片扫描而得,本站不作要求视为允许,下载前自行私信或留言给上传者【w****g】。
5、本文档所展示的图片、画像、字体、音乐的版权可能需版权方额外授权,请谨慎使用;网站提供的党政主题相关内容(国旗、国徽、党徽--等)目的在于配合国家政策宣传,仅限个人学习分享使用,禁止用于任何广告和商用目的。
6、文档遇到问题,请及时私信或留言给本站上传会员【w****g】,需本站解决可联系【 微信客服】、【 QQ客服】,若有其他问题请点击或扫码反馈【 服务填表】;文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“【 版权申诉】”(推荐),意见反馈和侵权处理邮箱:1219186828@qq.com;也可以拔打客服电话:4008-655-100;投诉/维权电话:4009-655-100。