遗传病的实验室检查手段-超级简化版.ppt
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1、遗传病的实验室检查手段进展遗传病的实验室检查手段进展北大医院实验中心北大医院实验中心戚豫戚豫 研究员研究员2024/5/11周六12007,Illumina推出推出Solexa;ABI推出推出SOLid 均能在均能在3天内完成天内完成1人的全基因组测序人的全基因组测序2024/5/11周六2遗传病和基因的数量?遗传病和基因的数量?遗传病总数:14,861种(Online-MendelianInheritanceinMan,OMIM,by2015-3-21)人类基因总数:24,000个人类各种结构和功能蛋白:100,000种89种表型和基因全清楚;4,381种表现找到致病突变意味着可做直接的基因
2、诊断的病种很少!已知序列:10,391个基因可做间接诊断的很多!2024/5/11周六3“遗传病遗传病”概念概念广义:所有疾病。因为一切人体正常生理功能广义:所有疾病。因为一切人体正常生理功能和病理状态都是由基因决定的和病理状态都是由基因决定的狭义:因基因突变而引发的疾病狭义:因基因突变而引发的疾病如何区分三个概念:如何区分三个概念:遗传性疾病:与环境因素引起的疾病对立遗传性疾病:与环境因素引起的疾病对立先天性疾病:可以是围产期感染先天性疾病:可以是围产期感染/药物所致药物所致家族性疾病:可能随着成员的迁出而终止家族性疾病:可能随着成员的迁出而终止2024/5/11周六4发病频率发病频率总计总
3、计占我国出生人口占我国出生人口5.6%5.6%;为全球平均;为全球平均5 57 7倍倍每一项只占万分之几到千分之几每一项只占万分之几到千分之几按系统分类排名前按系统分类排名前5位:位:神经系统:智力低下、代谢障碍、癫痫神经系统:智力低下、代谢障碍、癫痫心血管系统:先心病心血管系统:先心病内分泌系统:糖尿病、肾上腺皮质增生内分泌系统:糖尿病、肾上腺皮质增生生殖系统:不孕不育生殖系统:不孕不育骨骼系统:多指骨骼系统:多指/趾趾-并指并指/趾、软骨发育不良趾、软骨发育不良2024/5/11周六5先天性疾病的诱发因素先天性疾病的诱发因素遗传原因遗传原因后天环境所致,因素:后天环境所致,因素:物理:物理
4、:X-ray、微波、超声波、热、微波、超声波、热 化学:砷、铅、汞(水俣病)等无机物;化学:砷、铅、汞(水俣病)等无机物;橙剂、橙剂、EB(溴乙啶)等有机物(溴乙啶)等有机物 生物(感染):生物(感染):TORCH、EB、HIV、肝炎病毒等肝炎病毒等围产期因素诱变,但不肯定致病围产期因素诱变,但不肯定致病围产期因素只侵犯到个别器官,但注意与嵌合围产期因素只侵犯到个别器官,但注意与嵌合遗传(遗传(mosaic)区分)区分2024/5/11周六6如何检出?如何检出?高危人群高危人群环境暴露环境暴露既往病史既往病史家族史家族史感染史感染史迁居情况迁居情况 遗传遗传 DNA/RNA 环境环境无论外来病
5、原体还是本身异常,无论外来病原体还是本身异常,遗传物质遗传物质的检测都是有效手段的检测都是有效手段2024/5/11周六7实验室检测手段实验室检测手段,分辨率分辨率,和范围和范围染色体核型Karyotyping:109bp,2800倍镜下可见荧光原位杂交FISH:107bp,一个基因的一部分多重探针连接扩增多重探针连接扩增MLPA:105bp,几十个基因比较基因组杂交CGHArray:105bp,几个基因间接基因诊断:103105bp,一个或数个基因直接基因诊断PCR-Sequencing:1bp,一个基因Affymatricchip:1bp,数千个基因,半个基因组Genome-Wide-Se
6、quencing:1bp,全部2.4万个基因注:bp,basepair,碱基对2024/5/11周六8从核型核型;FISH;array CGH;MLPA;到CMA(chromosomalmicroarrayanalysis,染色体微阵列,分子核型分子核型)细胞遗传学与分子遗传学相结合的方法细胞遗传学与分子遗传学相结合的方法临床细胞遗传学的历史是伴随着一系列识别染色体方法的技术进步发展临床细胞遗传学基本工作:核型分析国内主要中期染色体核型,G显带在400条国外高分辨染色体核型,G显带在1500条条件:细胞培养,光镜,核型分析系统软件2024/5/11周六91、染色体核型、染色体核型 Karyot
7、yping基于显微镜下浓聚的染色体形态检查方法:G带、R带、Q带(550条,7组)高分辨染色体分带(1500条)FISH(荧光原位杂交):分裂间期染色体畸变种类:数目异常(整倍和非整倍)结构异常:-;+;t;del;ins;inv;dup;invdup;fra(X)(q27.3):脆性X;der:衍生染色体;r(13):13号染色体呈环状(暗示有缺失);i(Xq):等臂Xq2024/5/11周六102 2、荧光原位杂交技术、荧光原位杂交技术FISH(fluorescence in situ hybridization,)可以结合,但不依赖于核型分析单色与多色FISH,如SKY-FISH(光谱式
8、多色染色体)是鉴别基因组发生较大缺失或重复金标准不足:一次杂交识别的范围有限需要很好的临床诊断或其他提示,花费大人力多,设备高级方法:探针标记,细胞或染色体的原位杂交条件:探针(cosmid)、DNA提取、PCR、真空干燥、图像采集与分析2024/5/11周六11FISH需要条件需要条件荧光显微镜荧光显微镜+图像分析系统图像分析系统2024/5/11周六123、多重探针连接扩增、多重探针连接扩增 MLPA (multiplexligation-dependentprobeamplification)SchoutenJP第一次描述一种基于PCR反应,通过毛细管电泳鉴定扩增产物是一种高分辨的,用于
9、检测基因组序列拷贝数变异的方法(NucleicAcidsRes.2002Jun15;30(12):e57)2024/5/11周六13同时检测40个基因组序列异常,几乎每个染色体2个近端粒常有微缺失涉及不育、发育、智力,可一次查全仅需要20ng的DNA能检测单个外显子exon的拷贝数,探针辨认短的基因组序列,部分变性的DNA,如石蜡包埋,甲醛固定的样本均可使用相对定量40个mRNA,鉴定启动子的甲基化状态,检测已知的突变和SNPSMLPA方法功能、特点方法功能、特点2024/5/11周六14MLPA反反应应过过程程2024/5/11周六15MLPA结果判定结果判定相对峰域与对照相比减少相对峰域与
10、对照相比减少35-50%判定缺失判定缺失相对峰域与对照相比增加相对峰域与对照相比增加35-50%判定重复判定重复突变突变/多态性位于探针的连接点或与探针的连接多态性位于探针的连接点或与探针的连接点很近也可能导致相对峰域减少点很近也可能导致相对峰域减少单一的外显子缺失需要其他方法证实单一的外显子缺失需要其他方法证实结果分析结果分析2例例2024/5/11周六162024/5/11周六172024/5/11周六18MLPA需要条件PCR仪测序仪2024/5/11周六194、比较基因组杂交、比较基因组杂交(Comparative genomic hybridization,CGH)什么是CGH:19
11、92年Kallioniemi创立的基于荧光标记和分子、细胞遗传学技术鉴定基因组DNA的获得、丢失和扩增,并且可以把这些遗传变异定位在正常的中期染色体上的一种技术特点:在一个实验中,用一张中期染色体涂片分析全基因组的大的DNA序列拷贝数的不平衡改变(获得和丢失),即因剂量的变化而不需要分裂的细胞缺点:与测序相比分辨率不高,扩增子约2Mb,检出的缺失大小510Mb但也是个优点:容易辨识和解释1997年Solinas-Toldo建立Microarrary/array-CGH目前最通用的是美国安捷伦公司(Agilent)的平台,已成为国际上遗传病诊断、流产组织分析和种植前诊断PGD的第一线手段(fir
12、st-line)2024/5/11周六20MicroarraynBACs/PACsnDNA探针固定在玻璃片上探针固定在玻璃片上nArrayed by robotically printing DNA onto slidesnAgilent scannerOld array-CGH2024/5/11周六21Patient 2ThispatientpresentedtotheLaboratoryat12monthsofagewithinfantilespasmsanddevelopmentaldelay.Hisheadcircumferencewasbelowthe2ndcentileandwei
13、ghtwasbetweenthe10to25thcentile.Seizurescontinueddaily.Atareviewat32monthsbrachycephaly,lowanteriorhairline,hypertelorism,andalargeprotrudingtongueweresomeoftheadditionalfeaturesobserved.SubtelomericFISHrevealedadeletionofthedistal9qprobePAC112N13.Array-CGHshowedthepatienthasa1.5-1.8Mbdeletionofdist
14、al9q.FurtherFISHevaluationestablishedthedeletionas1.7MbwithbreakpointsbetweentheBACclonesRP11-83N9andRP11-695L17.2024/5/11周六2211qduplication10qdeletionPatient 5Malepatientwhopresentedat18yearsofagewithintellectualdisability,autismanddysmorphicfeatures.SubtelomereFISHshowedaunbalancedtranslocation,wi
15、thanadditionalcopyofthe11qprobePAC770G7presentondistal10q.Thedistal10qprobePAC137E24Gwasnotpresent.2024/5/11周六23Newarray-CGH?用不同的颜色荧光标记等量病人的测试和参用不同的颜色荧光标记等量病人的测试和参照照 DNA加入加入 Human Cot1DNA在在Microarray上进行杂交上进行杂交 杂交后洗去未结合的和错配的杂交后洗去未结合的和错配的靶靶 DNA高分辨扫描仪芯片高分辨扫描仪芯片2024/5/11周六24双色激光扫描n红色CY5n绿色CY3F值产生 refere
16、nce DNApatient=2024/5/11周六25真实扫描芯片图(8X60K芯片)分析软件界面2024/5/11周六26Cytoreport:给出23条染色体图和分析表格(列出部分)2024/5/11周六27什么是基因诊断?什么是基因诊断?狭义:针对致病基因的突变分析是一种直接的诊断扩展:利用致病基因的多态性(polymorphism);或利用相邻的多态性标记(polymorphicmarkers)进行连锁分析是一种间接的诊断广义:通过对疾病发生的基础,包括复制(DNA)、表达(RNA)和翻译(蛋白质)加以全过程分析所做出的诊断2024/5/11周六28基因诊断技术基础基因诊断技术基础:
17、PCR聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR):1985年发明,1992诺贝尔奖试管在热循环仪(PCR仪)中反应几小时,待测基因片段,专一地扩增上百万倍PCR过程:加热变性:加热变性:分开模DNA双链冷却复性:冷却复性:使引物与目标序列特异结合保温延长:保温延长:使引物按模板序列延长2024/5/11周六29PCRPCR产物检测产物检测PCRPCR反应场所反应场所 以及以及2024/5/11周六30不适合做不适合做PCR诊断的病种诊断的病种染色体病大片段基因缺失和重排所致的遗传病:解决办法:细胞遗传学,荧光原位杂交FISH、多重探针连接扩增MLPA、比较基因组杂交
18、CGH、基因芯片Affymatricarray和大规模全基因组测序基因巨大(Megabases)且无热点突变的遗传病:NF1、DMD、BMD、ADPKDetc.解决办法:杂交、酶学、代谢产物、功能分析,截短蛋白分析法(ProteinTruncationTest,PTT)、色谱、串联质谱2024/5/11周六31哪些遗传病可以做基因诊断哪些遗传病可以做基因诊断?需要查阅OMIM遗传病数据库()2024/5/11周六32哪些遗传病可以做基因诊断哪些遗传病可以做基因诊断?基因诊断适用范围和必要性基因诊断适用范围和必要性有器官组织差异性而不适合做组织活检的遗传病:有器官组织差异性而不适合做组织活检的遗
19、传病:longQT等心脏病、糖原累积症I型(vonGierke型)、癫痫等脑病诊断后可以治疗或提前预防发病的遗传病:诊断后可以治疗或提前预防发病的遗传病:如PKU、肝豆状核变性和G6PD缺乏症可以进行产前基因诊断的严重的先天代谢病,严重的精可以进行产前基因诊断的严重的先天代谢病,严重的精神疾患或恶性早期致死性疾病:神疾患或恶性早期致死性疾病:如性别畸形和性发育异常而找不到染色体异常。可通过选择性流产加以预防传统方法不能诊断、诊断不确切的家族性疾病:传统方法不能诊断、诊断不确切的家族性疾病:多以常显、X连锁和母系方式遗传。可做连锁分析2024/5/11周六33例如例如:家族性氨基甙类药物耳聋家族
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