DB21∕T 2537-2015 蓝舌病病毒荧光PCR检测方法.pdf
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1、 ICS 65.020.30 B 41 DB21 辽宁省地方标准 DB21/T 25372015 蓝舌病病毒荧光 PCR 检测方法 Method of the real-time RT-PCR for the detection of Bluetongue virus,BTV 2015-10-15 发布 2015-12-15 实施 辽宁省质量技术监督局 发 布 DB21/T 25372015 I 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。本标准由辽宁出入境检验检疫局提出并归口。本标准起草单位:辽宁出入境检验检疫局。本标准主要起草人:吴斌、万超、孙铭英。DB21/T 25372
2、015 蓝舌病病毒实时荧光 PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了蓝舌病病毒(Bluetongue virus)实时荧光PCR检测方法。本标准适用于蓝舌病病毒的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 3 缩略语 下列缩略语适用于本文件。Ct值:达到阈值的循环数(Cycle Threshold)DEPC:焦碳酸乙二酯(Diethylpyrocarbonate)
3、Taq酶:TaqDNA聚合酶(Taq DNA polymerase)RNA:核糖核酸(Ribonucleic Acid)实时荧光PCR:荧光逆转录聚合酶链反应(Real Time Fluorescent Quantitative Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)4 原理 采用TaqMan方法,比对蓝舌病病毒基因组S基因的核苷酸序列,设计特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针5端标记FAM荧光素为报告荧光基团(用R表示),3端标记TAMRA荧光素为淬灭荧光基团(用Q表示),它在近距离内能吸收5端荧光基因发出的荧光信号。PC
4、R反应进入退火阶段时,引物和探针同时与目的基因片段结合,此时探针上R基团发出的荧光信号被Q基因所吸收,仪器检测不到荧光信号;而反应进行到延伸阶段时,Taq酶的5到3的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R基团游离出来,所发出的荧光不再为Q所吸收而被检测仪所接收。随着PCR反应的循环进行,PCR产物与荧光信号的增长呈现对应关系。5 试剂和材料 DB21/T 25372015 除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水;所有试剂均用无RNA酶的容器分装。5.1 试剂 5.4.1 DEPC 水(见附录 A)。5.4.2 0.01mol/L PBS(见附录 A)5.4
5、.3 Trizol 裂解液。5.4.4 三氯甲烷。5.4.5 乳糖蛋白胨缓冲肉汤(BLP,见附录 A)5.4.6 75%乙醇(见附录 A)。5.4.7 异丙醇(-20预冷)。5.4.8 其他试剂:荧光 PCR 反应缓冲液:含 50mmol/L KCl(见附录 A),10mmol/L Tris-HCl(pH8.3)(见附录 A),2.5 mmol/L MgCl2(见附录 A)。可采用等效商品化试剂。5.4.9 dNTP Mixture(各 10 mM)、Taq酶(5 U/L)。引物:合成一对特异性引物:上游引物5-GTTCTCTAGTTGGCAACCACC-3,下游引物5-TGCACTGCTCA
6、GCAATCCA-3,TaqMan探针(FAM)5-AGTTCTCGTGG CATTTGCGTAATCC-3(TAMRA)均配制成 10 umol/L,-20 保存。5.2 仪器与耗材 5.4.1 荧光 PCR 检测仪。5.4.2 高速台式冷冻离心机(最高可达 13 000 r/min)。5.4.3 微量移液器:0.5 L10 L,5 L20 L,20 L200 L,100 L1000 L。5.4.4 混匀器。5.4.5 冰箱(2-8)。5.4.6 研钵。5.4.7 微量可调移液器。5.4.8 离心管。5.4.9 吸水纸。5.4.10 离心管 5.4.11 微量带芯吸嘴(10L,100L,10
7、00L)。6 生物安全要求 采样、样品处理及检测过程所涉及的实验操作,应遵守 SN/T 1193 的有关规定。7 操作步骤 7.1 样本的采集与处理 采样过程中样本不得交叉污染,采样及样品前处理过程中应戴一次性手套。7.4.1 取样工具 棉拭子、剪刀、镊子、研钵、离心管(Eppendorf管)。所有取样工具应经1.01105Pa,15min高压灭菌并烘干。7.4.2 采样方法 DB21/T 25372015 7.1.2.1 组织样品 用无菌的剪刀剪取待检样品5.0g后,再加10ml BLP(配方见附录A,含青霉素2000IU/ml、链霉素2000g/ml)加入于研钵中充分研磨,4浸提4h,取上
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