测序常见问题分析实例.doc
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4、们的一个质粒测序样品,用T7通用引物进行测序,从图中可以看出,在约285bp的polyT结构后,序列明显变乱。主要原因是在polyT结构后,测序酶容易在模板上滑动,导致polyT结构后的峰型变得杂乱。此类样品通过对其反向互补序列进行测序,一般可以得到好的结果。图2 移码突变双模板的存在 上图是我们的一个质粒测序样品,用M13+通用引物进行测序,从图中可以看出,该序列在290bp后序列明显有两套峰存在。造成该现象的原因可能有如下几条:序列发生缺失突变插入外援片段的载体和未插入外援片段的载体同时存在PCR产物用T载体进行克隆时,PCR片段可以以两个方向克隆进T载体所挑克隆不纯两个大小相近的PCR产
5、物同时存在,无法纯化分开解决的办法:对于质粒模板,重新挑选克隆,或从另一段进行测序对于PCR模板,用另一端引物进行测序,或克隆后进行测序图3 等位基因双模板的存在 上图是针对一个质粒进行的测序结果,从图中可以明显看出,在序列的80bp到120bp之间有两套峰存在,但是没有发生移码突变。该情况与图2所举的例子有所不同,该情况下从反向进行测序仍然不可能得到好的测序结果。该种情况下只能采取克隆的方法将两套模板分开,分别进行测序。信号迅速衰减 返回 图4 CTT重复结构 如上图,在大约260碱基后出现了一个严重的CTT重复结构,导致信号迅速衰减,很难得到跨过该区后的信息。该种情况下,只能从另一端进行测
6、序,一般来说,AAG重复结构不会太影响测序。也可以对片段进行亚克隆,使每个片段大小不大于200bp,然后再进行测序。不过,该方法要麻烦很多。图5 GGT重复结构严重影响测序 上图下半部分是一个质粒模板用M13+通用引物进行测序,大约在130bp开始,出现GGT重复结构,测序信号迅速减弱至消失。上图的上半部分是用M13-通用引物从反向进行测序,在反向序列上该重复是GGT的反向互补序列,即ACC,大约在500bp处,测序很轻松地就读过了ACC重复序列区。GGT重复结构严重影响测序的原因是在测序试剂盒中,为了得到均匀的测序峰型图,G和T碱基均进行了替代,分别替代成I和U,因此与模板的结合能力减弱,测
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