细胞重组与细胞融合.ppt
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1、第七章第七章 细胞重组与细胞融合细胞重组与细胞融合一、细胞重组一、细胞重组二、二、细胞融合细胞融合1可编辑版一、细胞重组一、细胞重组(一)概述(一)概述 1 概念概念 通过一定的实验技术,从活细胞中分离出细胞器及其组分,然后在体外一定条件下将不同细胞来源的细胞器及其组分进行重组,使其装配成具有生物活性的细胞或细胞器,又称细胞拆合。2 特点特点 细胞重组最初只在细胞核、质之间的移植,现在发展到可以人为的对细胞任何的不同组分进行组合,大大扩展了在细胞工程研究中的应用。2可编辑版 3 意义意义 1)研究核质关系 2)研究细胞器的功能及相互作用关系 3)研究细胞器的组装,甚至细胞的自我装配机理,以揭示
2、细胞起源与进化的机制。4)结合基因转移技术,可人为地使细胞表达新的性状和产生新的产物,实现掌握细胞、利用细胞、改造并进而创造出具有特定性状和功能的工程细胞。3可编辑版(二)细胞重组技术(二)细胞重组技术 细胞重组的方式及有关概念细胞重组的方式及有关概念 1)胞质体与完整细胞的融合形成胞质杂种;2)微细胞与完整细胞的融合形成微细胞异核体;3)胞质体与核体(小细胞)融合形成重组细胞(核质杂种)胞质体(cytoplast,cytosome):除去细胞核后由细胞膜包裹的结构。小细胞(minicell):又称核体,具有细胞核、带有薄层细胞质。微细胞(microcell):含有一个微核(仅有一条或几条染色
3、体)并带有薄层细胞质。4可编辑版1 显微操作技术显微操作技术 在显微镜下或借助于显微操作仪,用细微玻璃针或微吸管、微电极等对细胞进行人为操作。2 细胞分离技术细胞分离技术 1)梯度沉降分离法 2)等密度沉降分离法 3)流式细胞仪分离法3 细胞破碎方法细胞破碎方法 1)超声波破碎法 2)反复冻溶法 3)化学裂解法 4)高速组织倒碎法 5可编辑版4 细胞器的分离细胞器的分离5 胞质体、核体和微细胞的制备胞质体、核体和微细胞的制备 最常使用方法是:物理法结合显微操作技术 化学法结合离心技术制备 1)胞质体 首先用细胞松弛素B处理细胞诱发其排核,然后震荡离心分离得到胞质体。2)核体 在得到胞质体的同时
4、,离心收集排除的有完整细胞核,带有少量细胞质并围有完整细胞膜的结构便是核体。3)微细胞 首先用秋水仙素处理,染色体停滞在有丝分裂中期,体外培养过程中,在单个染色体或染色体周缘会重现核膜而形成含有一个微核、一薄层细胞质和一个完整质膜的微细胞。6可编辑版6 细胞器拆合重组举例细胞器拆合重组举例 细胞器的移植主要是指叶绿体和线粒体的移植。如卡尔森用白化型原生质体摄取正常的叶绿体,进而发育成正常的绿色植物;或有人用抗药型草履虫的线粒体植入敏感的草履虫细胞,使后者获得抗药性等。7可编辑版二、二、细胞融合细胞融合(cell fusion)(一)、细胞融合的概念细胞融合的概念 用人工方法把同种或不同种的两个
5、或两个以上的细胞,通过介导物作用,融合成一个细胞的技术。亦称体细胞杂交(somatic hybridization)8可编辑版(二)、(二)、细胞融合的意义(应用)细胞融合的意义(应用)1 进行基因定位,绘制人类基因图进行基因定位,绘制人类基因图基因定位的方法基因定位的方法家系分析法细胞融合法基因剂量效应法重组DNA法分子杂交法限制性片段长度多态性技术脉冲电泳法(PEGE)基因图基因图:指将人类染色体上所有基因按其具体位置、次序和间隔距离详细地排列而成的图,又叫染色体连锁图9可编辑版2 诱导诱导PC染色体染色体3 体细胞杂种的致瘤性分析体细胞杂种的致瘤性分析4 遗传缺陷的基因互补遗传缺陷的基因
6、互补5 分化功能表达调控的研究分化功能表达调控的研究6 淋巴细胞杂交瘤技术与单克隆抗体淋巴细胞杂交瘤技术与单克隆抗体由单个杂交瘤细胞增殖产生的克隆细胞群分泌的高度纯一的抗体称为单克隆抗体7 植物细胞的原生质体融合培育杂种植株植物细胞的原生质体融合培育杂种植株8 核质相互作用关系核质相互作用关系9 基因治疗基因治疗10 疾病诊断疾病诊断10可编辑版(三)、细胞融合的机理细胞融合的机理 膜融合是两个不同的膜相互接触和融合,导致两膜脂和膜蛋白的相互混合及两侧内含物的混合。细胞融合的基本步骤包括:1 细胞密切靠近 2 细胞桥形成 3 细胞质渗透 4 细胞核融合11可编辑版12可编辑版13可编辑版 融合
7、机制种种融合机制种种1)“脂无序脂无序”模型模型 Lucy,1970-19752)Ca2+诱导的侧向诱导的侧向“相分离相分离”模型模型 Papahadjopoulos 19783)六角形)六角形HII构象与膜融合构象与膜融合 Cullis and Hope19784)Ca2+诱导局部脱水与膜融合诱导局部脱水与膜融合 Wilschut and Hoekstra 19845)渗透模型与膜融合)渗透模型与膜融合 Lucy 19866)质子泵驱动膜融合)质子泵驱动膜融合 刘树森1986 膜融合过程大体概括为两大阶段:首先是两膜脂相互聚合和接触,其次是接触部位的局部脱水,形成不稳定中间结构,使膜脂发生混
8、合而最终导致膜的融合14可编辑版(四)、细胞融合的材料细胞融合的材料1 植物或微生物原生质体的制备2 动物单个细胞的获得 酶解消化法(胰蛋白酶、胶原酶)15可编辑版(五)、(五)、细胞融合的方法细胞融合的方法1、生物法、生物法病毒诱导细胞融合病毒诱导细胞融合 仙台病毒(仙台病毒(Sendal virus)又称日本血凝性病毒又称日本血凝性病毒(HVJ),),是一种是一种RNA病毒,病毒,1962年冈田善雄发现年冈田善雄发现,能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞。,能引起艾氏腹水瘤细胞融合成多核细胞。引起细胞融合的有效部位在于它的细胞膜成分,引起细胞融合的有效部位在于它的细胞膜成分,特别是磷脂成分,
9、而与核酸活性无关。特别是磷脂成分,而与核酸活性无关。16可编辑版2、化学法、化学法PEG结合高结合高Ca2+、pH诱导法诱导法1)高级脂肪酸衍生物2)脂质体3)钙离子4)水溶性高分子化合物聚乙二醇(PEG)最为常用 5)水溶性蛋白质和多肽(如牛血清蛋白)20世纪70年代,华裔加籍科学家高国楠发现PEG能促进植物原生质体融合,开辟了植物细胞融合的研究。目前化学法主要包括:NaNO3诱导、高Ca2+、和pH诱导、PEG诱导、PEG结合高Ca2+和pH诱导等,后者最为常用。17可编辑版A、基本原理基本原理 PEG(polyethylene glycol)是一种多聚化合物,分子式为H(OHCH2-CH
10、2)nOH,平均分子量在20020000之间。诱导机制可能是由于带有大量负电荷的PEG分子和原生质体表面的负电荷间在钙离子的作用下形成静电键,促使原生质体间的黏着而结合,导致电荷平衡失调并重新分配,使两种原生质体上的正负电荷连接起来,进而形成具有共同质膜的融合体。18可编辑版B、基本过程及注意事项基本过程及注意事项 (1)亲本原生质体事先做好识别标记(色素、缺陷型、抗性标记等)(2)原生质体密度在105/ml左右,比例1:1 (3)PEG分子量通常为40006000,浓度50%(4)加入PEG后迅速混匀,置24培育1020min,然后缓缓加入高pH、高钙离子溶液,15min后用洗涤液洗涤,离心
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