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微生物限度检查法.ppt
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1、微生物限度检查法1.1微生物限度检查法概述2我国药品微生物限度标准的发展情况3我国药品微生物限度检验方法的发展情况4微生物限度检查法所需的材料5微生物限度检查试验用物品的准备6无菌室技术要求7细菌、霉菌与酵母菌的检查方法供试品的抽样、保存及检验量试验操作前的准备供试液的制备对照用菌液的制备2.菌数测定阴性对照试验细菌、霉菌(酵母菌)检验程序供试液的稀释(10倍递增稀释法)注平皿倾注培养基培养菌落计数菌数报告规则注意事项8.细菌、霉菌(酵母菌)的其他检查方法管稀释法(试管法、MPN法)滤膜法计数板法仪器法平板涂布法3.表面涂抹平板法滤膜培养法酵母菌镜检计数法9.大肠杆菌检查法概述、原理检验程序增
2、菌培养分离培养纯培养、革兰染色、镜检生化试验(IMViC)实验中的注意事项10沙门菌检查法11铜绿假单胞菌检查法12金黄色葡萄球菌检查法13破伤风梭菌检查法14活螨检查法15结果判断4.1微生物限度检查法的意义药品是防病治病、关系用药者生命健康的特殊商品,必须保证其质量,用药的安全与有效。微生物污染药品引起的药源性疾病屡见不鲜,在国内外均有报道。为保证药品质量,必须对微生物污染进行必要的控制和检验。其意义在于:已有许多实例表明,药品污染微生物不仅危及病人用药安全,而且也直接影响药品的有效性,所以药品卫生质量是药品质量不可分割的部分。反映药品生产工艺的科学性、合理性及质量管理水平。通过检验,凡工
3、艺条件、生产管理水平、生产人员的素质差,不注意文明生产的单位和企业,其生产的药品,染菌必然严重,不合格率无疑就高。微生物限度的检验是提供药品卫生质量状况的重要依据,因而保证销售与使用过程中药品的有效性与安全性,是促进与提高生产单位全面质量管理水平与提高药品质量的重要依据。微生物限度检查法概述5.2微生物限度检查的范围根据药品使用的要求,可划分为两大类:规定灭菌的药品:包括注射剂和输液剂,及用于体腔、严重烧伤、溃疡、出血及眼科用药等制剂。非规定灭菌药品:包括常用的口服制剂与一般外用制剂。对这一部分制剂一般不要求绝对无菌,允许一定限量的微生物存在,但同时规定不得有可疑致病的细菌存在。由于致病菌的范
4、围很广,各国药典都规定了几个常见的致病菌或指标菌作为控制菌。在非规定灭菌的制剂中,对每克或每毫升的药品按剂型或品种不同规定:染菌量检查:包括细菌数、霉菌数及酵母菌数测定,以检查这几类微生物对药品的污染程度。控制菌检查:包括大肠埃希菌、沙门菌、金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌的检查等。6.3药品微生物限度检查抽样量与检验量药品微生物限度检验中的困难,最根本的原因在于检验对象本身的特殊性。药品微生物限度检验对象的特性:不确定性:药品受外来微生物的污染,这种污染是可无可有;在有中又可多可少;其种类可以多样。污染的情况可依生产、设备、原材料、管理、剂型等条件而定,非药品本身所固有。所以微生物限度检查的对象
5、是不确定的。药品所规定的检查项目,除无菌检查、热原检查具有上述性质,其他项均无此特征。这一点往往被忽视。污染对药品而言是一个意外事件。污染批号中的不合格品是一个随机变量。分布的不均匀性:不均匀性是不确定性的另一种表现形式,在一个批号内产品有的被污染,有的不被污染,分布不匀;在被污染的部分中有的数量极多,有的较少,种类上可以复杂或较单一。这种不均匀性源于污染源的复杂性;原辅料污染、工艺污染、空间污染7.和操作人员污染等等构成污染量的多少差异,形成不均态。再者,微生物具有簇团性;簇团大小、紧密程度是可遗传的,簇团的分散性差异极大,该特点无疑强化了不均匀性。活体特征:药典中以活的微生物作为检验对象也
6、是独特特性。由于以上特殊性,抽样对微生物限度检测值将产生很大的影响。当药品无污染时,抽样将不影响检验,当批产品存在污染品时,抽样的样本是随机变量,抽样的影响如下:抽样方法:不同的抽样方法对批产品总体的代表性是不同的,测定值也是有差异的。如抽取可疑样品与随机抽样,其检出率与数字显然前者大于后者。抽样量:抽样量的多少,对样本的代表性极为重要,如含10不合格率的批产品,从中抽取2件数为样本进行控制菌检验时,有81机率判定为合格品,而抽取30件数时,会有96机率判定为不合格品。8.以上表明抽样方法、抽样数量、抽样次数均影响测定结果。以控制菌检验为例,决定染菌检出与否必须具备两个条件:(A)样品是否是含
7、染菌的样品;(B)检验操作正确无误,其中(A)是前提条件。中国药典2000年版关于抽验方法与抽样数量规定:供试品为随机抽样,一般抽样量为检验用量(两个以上最小包装单位)的3倍量。对异常的供试品应针对性的抽样,对外观可疑污染或对有争议复验的样品应抽取可以污染和有争议复验的原样品。对异常的供试品应针对性的抽样,对外观可疑污染或对有争议复验的样品应抽取可以污染和有争议复验的原样品。凡能从药品、瓶(外盖内侧及瓶口周围)外观看出发霉、生虫以及变质的药品不必再继续检验,应直接判为不合格。不能以有时外观有上述情况而检验内容为合格,来判定该药品合格,因为瓶口染菌,对服用者是不安全的,如自瓶口直接服药时,所染菌
8、随之进入人体,同时发现瓶口一旦染菌,瓶内药液最终要受到污染。检验量与抽样量是两种不同范畴的量,后者指从全批产品9.(或抽样全过程)抽取的单位包装,前者是指检验用量,一般抽样量大于检验量。检验量只是抽样量各包装的混合样品的一部分。中国药典2000年版规定检验量为每次最少应分取两瓶(盒)以上的样品共10克或10毫升,中药蜜丸至少应分取4丸以上共10克。目前我国以1克或1毫升、膜剂以10cm2作为报告单位;英美药典及欧洲药典也是以1克或1毫升作为限量,但控制菌有的是以10克或10毫升作为限量,比我国的限量规定严格。总之,抽样量和检验量大小对检验结果影响较大(尽管目前抽样方案还存在不科学,漏检率高)。
9、由于药品微生物检验是破坏性检验,检验1瓶(盒)会破坏1瓶(盒),检验量愈大,则破坏性愈大,尤其对贵重药品,生产单位、经营单位损失也就越大。因此,如何确定适宜的既能满足抽样检验基本要求,又能使生产、经营者可接受的抽样方案,是目前需要解决的问题。但目前的规定必须遵循,不能随意变动,尤其不能减少(除对贵重、微量包装的药品可酌情减少检验量除外)。10.微生物限度检验方法的发展情况11980年我国药品微生物限度检验工作正式发行药品卫生检验方法。21984年出版第二版药品卫生检验方法。31990.12年中检所出版第三版,主要对原方法中各地反映意见较多的问题进行了改写;增加了部分检验方法和供试液的制备方法;
10、为了同国内外检验方法相协调,对某些内容作了相应的更改,此外,还参照国家标准的编写格式作了编排。41990年版药典第二增补本收载了微生物限度检查法。这也是我国首次在药典上收载此方法。51995年版药典也收载了此检查法,少数剂型收载了限度规定。(20个化学药品规定限度)。11.6、2000年版药典一、二部同时收载了检查法和限度标准。首次把微生物限度检查法和限度标准同时发布。12.微生物限度标准发展情况11972年开展此项工作21978年颁布我国第一个“药品卫生标准”31986年颁布修改后的“药品卫生标准”,1987年12月1日起供内部执行41989年下达“药品卫生标准补充规定和说明”51990年版
11、药典第二增补本收载了20个化学药品种的微生物限度标准规定,与国际惯例一致61995年版药典少数几个剂型(滴眼剂等)收载了微生物限度。规定按微生物限度检查法检查不得有菌生长72000年版药典按剂型、中西药分类规定微生物限度,还对几个生化药品在各论中项下作了具体规定13.实验所用的培养基营养琼脂培养基玫瑰红钠琼脂培养基酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD)胆盐乳糖培养基(BL)4甲基伞形酮葡糖苷酸蛋白胨培养基(MUG)乳糖培养基5乳糖培养基蛋白胨水培养基磷酸盐葡萄糖胨水培养基枸橼酸盐培养基曙红亚甲蓝琼脂(EMB)麦康凯琼脂(MacC)营养肉汤14.微生物限度检查常用检验设备及器材恒温培养箱3035
12、361霉菌培养箱2528恒温水浴箱451净化工作台生物显微镜1500X体视显微镜或放大镜电冰箱电热干燥箱250300高压蒸汽消毒器电子天平或药物天平感量0.1g匀浆仪或研钵锥形瓶100ml,250ml,500ml,1000ml15.直形吸管1ml,10ml量杯10ml试管18x180mm,13x200mm,30 x200mm试管筒培养皿9cm培养皿筒陶瓦盖12cm量筒100ml,500ml,1000ml滤器及微孔滤膜孔径0.450.02um注射器1ml,5ml,10ml,30ml载玻片及盖玻片接种针及接种环试管架16.乙醇灯康氏振荡器离心机5004000min紫外灯365nm玻璃或搪瓷消毒缸(
13、带盖)大、小橡皮乳头乙醇棉球或碘伏棉球灭菌剪刀、镊子、钢锥灭菌称样纸灭菌不锈钢药匙火柴、记号笔(玻璃铅笔)白瓷盘、洗手盆实验记录纸17.细菌、霉菌与酵母菌的检查方法(平皿菌落计数法)(一)供试品的抽样、保存及检验量1供试品应随机抽样。一般抽样量(2个以上最小包装单位)为检验量的3倍量。2对异常的供试品应针对性的抽样。抽样时,凡发现有异常或可疑的样品,应选取有疑问的样品,但机械损伤、明显破裂的包装不得作为样品。凡能从药品、瓶口(外盖内侧及瓶口周围)、外观看出长螨、发霉、虫蛀及变质的药品,可直接判为不合格,无需在抽样检验。不能以外观有上述情况而检查内容物合格,来判断该药品合格。3供试品收检后应及时
14、检验,若有困难,应存放在该品种规定的储存条件下(一般为阴凉干燥处),勿冷藏或冷冻,以防供试品内污染菌因保存条件不妥引起致死、损伤或繁殖。18.4供试品在检验之前,应保持原包装状态,严禁开启,包装已开启的样品不得作为供试品。5供试品的取样必须在净化条件下无菌操作,严防再污染。(原料药、装量大的药)6有剂型检验量均需取自2个以上包装单位(中药蜜丸、膜剂,除需取自2个以上包装外,还应取4丸、片以上样品)。7固体及半固体(粘稠性供试品)制剂检验量为10克。8液体制剂检验量为10毫升。9膜剂除另有规定外,中药膜剂检验量为3050cm2,化学膜剂及生化药膜剂检验量为100cm2。10贵重的或微量包装的供试
15、品检验量可以酌减,除另有规定外,口服固体制剂不低于3克,液体制剂采用原液者不得少于6毫升,采用供试液者不得少于3毫升,外用药品不得少于5克619.(二)实验操作前的准备1将供试品及所有已灭菌的平皿、锥形瓶、匀浆杯、试管、研钵、吸管(1ml10ml)、量筒、稀释剂等移至无菌室内。每次实验所用物品必须事先计划,准备足够用量,避免操作中出入操作间。编号后将全部外包装(牛皮纸、布)取掉。另外还有增菌液、培养基(营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基,保持在45左右的水浴中)、MUG培养基试管等.湿热灭菌的物品称量纸、手术镊子、剪子等.干热灭菌的物品2开启无菌室紫外杀菌灯和空气净化装置,并使其工作不少于30
16、分钟。3操作人员用肥皂洗手,关闭紫外杀菌灯,进入缓冲间,换工作鞋。再用0.1苯扎溴铵溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手,穿戴无菌衣、帽、口罩。20.4操作前先用乙醇棉球擦手,再用碘伏棉球(也可用乙醇棉球)擦拭供试品瓶、盒、袋等的开口处周围,待干后用灭菌的手术镊或剪将供试品启封。(三)供试液的制备(1:10供试液)按供试品的理化特性与生物学特性采取适宜的方法制备供试液。不得改变污染微生物的数量和种类。1液体供试品取供试品10ml,加入到稀释剂90ml中,混匀,作为供试液。(有的书上讲取10ml,置灭菌锥形瓶中,加入90ml稀释剂,摇匀)。油剂可加适量聚山梨酯80;21.气雾剂、喷雾剂供试品将供试
17、品置冰室内2hr后,取出,用灭菌钢锥小心钻孔,使抛射剂缓慢释放,然后用灭菌注射器加入稀释剂,混匀后吸取相当于10g或10ml供试品,再稀释成1:10供试液。USPXXIV规定是抛射剂导出后,吸取10ml或取10g供试品,加稀释液使成100ml。合剂(系指含蜂蜜或王浆者)与滴眼剂可用供试品作为供试液。(滴眼剂不得检出霉菌和酵母菌)。含蜂蜜、王浆的制剂2固体、半固体或粘稠供试品称取供试品10g,置装有0.9无菌氯化钠100ml的匀浆杯中,用匀浆仪(30005000r24min),或其他适宜方法(振荡器或研钵研磨等方法分散混匀,作为供试液。在制备过程中,必要时可加适量聚山梨酯80,并适当加温,但不应
18、超过45。22.3非水溶性供试品软膏剂、乳化剂称取供试品5g(5ml),加入含已灭菌熔化并保温45左右的司盘8050g、单硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯8010g混合物的烧杯中,用无菌玻棒搅拌成团后,慢慢加入45左右的0.9无菌氯化钠溶液约80ml,(实际测可能是85ml),边加边搅拌,使供试品充分乳化,作为供试液(1:20)。油剂取供试品10ml,加入无菌聚山梨酯8058ml,摇匀,再加入稀释剂至100ml。栓剂称取供试品10g,置灭菌锥形瓶中,加适量稀释剂,置45左右水浴保温10min,使溶,加入无菌聚山梨酯8058ml,振摇使之乳化,再加稀释剂(稀释剂和聚山梨酯80总量为100ml),摇匀2
19、3.茶剂取供试品10g,置灭菌锥形瓶中,加入稀释剂100ml,振摇30秒,以灭菌纱布过滤(如为袋泡茶,可直接取2袋,以称样结果按1:10加稀释剂,浸泡30分钟)。胶丸剂(如鱼肝油丸等)同胶囊剂胶剂(如阿胶)取胶剂若干,捣碎,称取10g,再用研钵研细,转入250ml锥形瓶内,加入稀释剂100ml,置451水浴中,振摇使溶,即为1:10供试液。胶丸剂(如鱼肝油丸等)同胶囊剂胶剂(如阿胶)取胶剂若干,捣碎,称取10g,再用研钵研细,转入250ml锥形瓶内,加入稀释剂100ml,置451水浴中,振摇使溶,即为1:10供试液。24.4含抑菌成分供试品(仅限检查控制菌时用)凡含防腐剂或抑菌成分且影响检验(
20、供试品按常规检查法,加入规定量的对照菌,不能检出时)的供试品,可根据供试品的性质,控制菌的特性及检验条件等按以下方法之一或两种以上方法联合应用处理后,依法检查。同时做阳性和阴性对照。药典规定:供试品如干扰控制菌检验,按以下方法处理后,依法检查。实际操作中:先把供试液离心(500r/min5min)这样菌体在上层,吸取上清液过滤,把滤膜直接贴在培养基上培养即可,具体吸取上清液10ml还是100ml按品种要求自己定。取10ml过滤测出来的是个克,取100ml过滤测出来的是个10克。(限度检查)稀释法:将供试品种入较大量的培养基中,使该供试液稀释至不具抑菌作用的浓度(使该供试液稀释至阳性对照菌能生长
21、的浓度)。此法用作控制菌检查和限度检查。本法适用于抑菌作用不强的中药、化学药品的检验。25.离心沉淀集菌法:取规定量的供试液于无菌刻度离心管中,离心(每分钟3000转)30分钟,弃去上清液,留底部集菌液约2ml,再稀释成原规定的供试液。如有不溶性药渣,可先离心(每分钟500转)5分钟,取全部上层液,再行集菌处理。本法适用于一些抑菌作用不强的中、西药品,如蜜丸、水丸、片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂及液体制剂。应用本法需严防操作污染,并注意上层液或上清液和底部残渣的分离,避免沉渣混入其中。薄膜过滤法:取规定量的供试液,置稀释剂100ml中,摇匀,以无菌操作加入装有直径约50mm、孔径不大于0.45um
22、0.02um的微孔滤膜过滤器中,减压抽干后,用稀释剂冲洗滤膜3次,每次50100ml,取出滤膜备检。冲洗时每次最好不少于100ml,可以将培养基加入滤器或取出滤膜,加入增菌培养基中,可以用加入滤器中供试品的量来控制检验量,也可以把滤膜取出来剪成24片,使每片相当于供试品1g或1ml,放入增菌培养基中,作控制菌检验。26.本法适用于水溶性抑菌成分的中、西药品和滴眼剂等制剂的“灭活”处理。安放滤膜时,注意滤膜与滤器应密合,防止滤膜破损、漏液。本法所用滤膜孔径0.45um0.02um。(钝化)中和法:凡含磺胺、汞、砷类或防腐剂的供试品,可用相应的试剂钝化活性因子,中和毒性后制成供试液。磺胺类药物中和
23、法取规定量含磺胺类的供试品,于100ml增菌液中加入含1对氨基苯甲酸约15ml(以前讲加入0.5ml)。本法用于含磺胺较少的制剂,如:三黄软膏、消炎眼药水、斑马眼药水等。应用本法可因供试品的不同,对氨基苯甲酸的用量可适当调整。含砷、汞等重金属药物中和法,取规定量的供试品,加入硫乙醇酸盐培养基100ml中,作增菌培养。27.本法适用于含重金属盐类药物的检验,如磺胺嘧啶银软膏等。含洗必泰等防腐剂的供试品中和法,取规定量的供试品,加入含适量聚山梨酯80等表面活性剂的100ml增菌液中(表面活性剂的用量应预试,用量过大有抑菌作用)。本法适用于洗必泰含片、洗必泰栓、霉滴栓剂及其它含抑菌成分的供试品。应用
24、本法需注意,由于供试品不同,表面活性剂的用量应预试,用量不宜过大,否则本身易产生抑菌作用。沉降法:(药典上没收载此法)取规定量的供试液,自然沉降5分钟,取上层液于100ml增菌液中,作增菌培养。本法用于单一成分固体制剂如磺胺嘧啶片。取规定量的供试液,自然沉降5分钟,吸取上层液于(含1对氨基苯甲酸1ml)100ml增菌液中,作增菌培养。本法适用于复方磺胺制剂,如复方磺胺嘧啶片、复方新诺明片等28.以上两法适用于难溶于水的抗菌制剂。如磺胺类药应用沉降法时,供试品应充分研细,并与稀释剂充分摇匀,使污染菌分散于液相中;沉降时间不宜超过5分钟,以防菌细胞下沉;取上清液时,避免吸入药渣。(四)对照用阳性菌
25、液控制菌检查均应作相应已知菌的阳性对照试验。对照菌株为大肠杆菌CMCC(B)44102、沙门菌CMCC(B)50094、铜绿假单胞菌、CMCC(B)10104及金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003制备:取相应菌株的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳,接种至营养肉汤培养基内,培养1820小时后,稀释至1:106。对照菌的加入量为50100个。CMCC医学微生物菌种保藏管理中心。国内药品微生物检验所用的菌种主要是CMCC(B)、CMCC(F)菌号,B(bacteria)代表细菌,F(fungi)代表真菌。中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏管理中心提供这些干燥菌种。29.(五)平皿菌落计数
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