血红蛋白电泳的意义和判断.ppt
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1、1.目的血红蛋白结构和功能的回顾SebiaCAPILLARYS2/Minicap血红蛋白检测说明血红蛋白临床结果说明2.血红蛋白的结构血红蛋白分子是由4条多肽链(2对)和4个可以结合铁和氧气的血红素.Normalhemoglobins,containalpha,beta,delta,and gammaglobinchains.3.三维结构4亚单位2alpha链2alphagenes3非alpha链:beta,delta,gamma1 gene,1gene,2g genes4.正常结果HbA:22HbF:2g2HbA2:22+-琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶 Hydrasys(Sebia)碱性缓冲液碱性缓
2、冲液成人成人新生儿新生儿5.血红蛋白遗传病类型(HEMOGLOBINOPATHIES)?血红蛋白疾病血红蛋白疾病血红蛋白性质变化:血红蛋白分子病结构异常,一个或数个氨基酸变异或缺失,都将会导致血红蛋白分子的电性发生改变常见血红蛋白变异体-globin:SCDPunjab E血红蛋白含量变化:地中海贫血地中海贫血合成或合成调控异常:globinThalassemiasglobinThalassemias合并型:血红蛋白分子病Hemoglobinopathies/地贫Thalassemias6.血红蛋白遗传病遗传性疾病基因学图谱正常基因异常基因7.异常血红蛋白类型目前,已经证实的有超过1000种以
3、上的变异体(,g and)大部分变异体出现频率较低,并且没有明显临床症状4种主要变异体(HbS,HbC,HbEandHbDPunjab)出现频率较高(特定人群)携带者会出现健康问题儿童可能在出生时即伴随有严重症状8.血红蛋白疾病的区域分布图Thalassemias9.常见与地中海区域:意大利,西班牙,希腊,近东地区,非洲北部.同样常见于东南亚:泰国,印度,越南,中国,印尼.o临床症状*Beta地贫重症型-严重贫血(需要长期输血治疗)*Beta地贫中间型*Beta地贫轻微型-无临床症状Beta 地中海贫血o常见区域o 没有Beta链合成+合成能力下降10.Alpha 地中海贫血o临床症状:根据A
4、lpha基因的表达状态,有4个不同程度的Alpha地贫症状*1个基因表达沉默:静止型(非常难检测到,在出生会测到HbBarts1-2%)*2个基因表达沉默:轻型alpha地贫,在出生会测到Barts2-10%*3个基因表达沉默:血红蛋白HbH病,出生时出现2-30%Barts,儿童-成人出现10-15%HbH*4个基因表达沉默:HbBarts胎儿水肿综合征(死胎)o常见区域常见与远东地区,非洲和地中海区国家11.其他特征其他特征Hb HHb A2Hb F贫血贫血小红细胞小红细胞靶细胞靶细胞异常异常出生时少量出生时少量的的(2%)Hb Barts0正常正常000一条链缺失出身时出身时Hb Bar
5、ts(5%)0正常或减少正常0002条链缺失不稳定血红不稳定血红蛋白溶血性蛋白溶血性贫血贫血(Hb H)10-15%减少也许增加轻微的到严重的+3条链缺失胎儿水肿综胎儿水肿综合症合症(hydrops fetalis)00100%Hb Barts严重的-4条链缺失12.基因型基因型诊断诊断血常规血常规临床症状临床症状检测结果检测结果aa/aaaa/aa无HbA:NHbA2:N(2-3.5%)-a/aa-a/aa-Thalassaemia 2杂合体(静止型)轻微小红细胞症MCV:75-80fLMCH:20-24无HbAandHbA2:NHbBarts0-3%atbirthConfirmation
6、by molecularbiology-a/-a-a/-a-Thalassaemia 2纯合体小红细胞症血红蛋白减少Hb:11-12g/dL无明显临床症状HbAandHbA2:NHbBarts2-8%atbirth-/aa-/aa-Thalassaemia 1杂合体MCV:65-75MCH:20-24需要分析序列分析或DNA序列分析-/-a-/-aHbH小红细胞症血红蛋白减少Hb:8-11g/dLMCV:55-65MCH:20-24出现溶血脾脏肿大HbA2NorHbBarts5%HbH10-20%-/-/-Thalassaemia 1纯合体(死胎)严重贫血水肿胎Hb:8-11g/dLMCV10
7、0-110MCH无法存活死胎AbsenceofHbAandHbFHbBarts80-100%HbPortland5%13.镰刀型红细胞血症变异体出现在6GAG(谷氨酸)GTG(缬氨酸)NSSASabnormal gene abnormal gene normal gene normal gene NHbSN NHbSASNHbAHbSN NSSHbAHbSChromosomes 16a2a2a1a1a2a2a1a1HomozygoteChromosomes 11Htrozygoted db bd db bAg gAg gGg gGg gd db bd db bAg gAg gGg gGg gC
8、hromosomes 16a2a2a1a1a2a2a1a1HomozygoteChromosomes 11Heterozygoted db bd db bAg gAg gGg gGg gd db bd db bAg gAg gGg gGg g14.C型血红蛋白分子病变异体位置:AA6:GAG(谷氨酸)AAG(Lys)HbAHeterozygoteACHbAHbCN NHbASCCompoundheterozygotyHbAHbCN NHbSHtrozygotecompositeACSCChromosomes 16a2a2a1a1a2a2a1a1HomozygoteChromosomes 11H
9、trozygoted db bd db bAg gAg gGg gGg gd db bd db bAg gAg gGg gGg gChromosomes 16a2a2a1a1a2a2a1a1SCheterozygotecompoundChromosomes 11Heterozygoted db bd db bAg gAg gGg gGg gd db bd db bAg gAg gGg gGg g15.D型血红蛋白分子病常见区域:常见于印度.特点:变异体位置121Glu(谷氨酸,负电荷)Gln(谷氨酰胺,不带电荷)(D-LosAngeles=D-Punjab)(6differentHbDacco
10、rdingtothepositionofthemutation)碱性缓冲液中:电荷下降M电泳速度变度变慢电泳速度变度变慢,靠近靠近Hb S临床症状:基因杂合体:无症状无症状(仅在电泳中发现仅在电泳中发现D D区带区带)HbAfraction:6570%HbDfraction:3035%基因纯合体:轻微贫血HbAfraction:absenceHbDfraction:100%16.E型血红蛋白分子病常见区域:常见与东南亚地区.特点:变异位点26Glu(谷氨酸,负电荷)Lys(赖氨酸,正电荷)碱性缓冲液:总体带电荷下降凝胶电泳中凝胶电泳中,出现在出现在HbC附近附近临床症状:杂合体:无症状无症状H
11、bAfraction:6570%HbEfraction:3035%基因纯合体:轻微贫血HbAfraction:absenceHbEfraction:100%17.下列情况下,需要进行血红蛋白检测临床和遗传问题(产前诊断)贫血,小红细胞症 新生儿筛查对来自地贫高发区人口,进行筛查对诊断有帮助的其他信息患者临床症状,年龄,籍贯和其他相关的背景(输血记录)血液全套检测,网状细胞级别和进行细胞形态镜检 Hb电泳(EDTA抗凝管)离子平衡和溶血情况18.血红蛋白检测的几种方法目前,血红蛋白检测步骤如下:-电泳法对Hb进行检测或者使用等电聚焦电泳法-使用HPLC法进行确认.19.凝胶电泳结果识别表 20.
12、在pH梯度的凝胶片上,根据蛋白不同的等电点,对蛋白进行分离Hb电泳位置取决于缓冲液PH值蛋白电泳至其等电点位置后,停止泳动AtpI=pH,Hbdoesnothaveanetchargeandstopsmigrating电泳分离效果好,但时间长.需要经验丰富才能获得良好结果及进行结果判断等电聚焦电泳法21.介于普通电泳和等电聚焦电泳之间的新方法:-通过毛细管电泳法,即可以获得与IEF方法一样的分辨率,同时检测结果量值HbA2/HbF同样精确.-出现异常变异体后:使用下列方法确认:*ITANOtest(solubilitytest)*HPLC液相色谱*Genotyping基因筛查22.Capill
13、arys2Capillarys2MinicapMinicap全自动毛细管电泳法进行血红蛋白检测 Capillarys 2/Minicap23.毛细管电泳法原理毛细管电泳法原理 Peltier温控桥Anode+Cathode-检测器氘光灯电泳电泳高电压高电压24.此时此时,电渗力电渗力(EOF)(EOF)远远强于电场力远远强于电场力.因此因此,蛋白被动从正极向负极端移动蛋白被动从正极向负极端移动.正电极正电极正电极正电极 +EOFEOF负电极负电极负电极负电极-ElectroElectro migrationmigration蛋白电泳蛋白电泳DETECTIONDETECTIONINJECTION
14、INJECTION带正电荷的缓冲液带正电荷的缓冲液毛细管壁负离子鞘毛细管壁负离子鞘25.Capillarys/Minicap血红蛋白电泳血红蛋白条带,在电渗力的作用下,8分钟即完成电泳过程,然后,在415nm紫外光下被检测并显示出来.正常质控品正常质控品必须在每天检测前使用Capillarys:-检测速度:40样品/小时-试管架1至7号位放置样品,8号位放4ml溶血素Minicap:-检测速度:10样品/小时-试管架1至26号位放置样品,27号位放溶血素(8个样品消耗5ml溶血素)26.Capillarys/Minicap血红蛋白检测标本要求抗凝管采血(EDTA,heparin,citrate
15、).如果需要对输血患者采血,需要在输血前采集血液.使用去除血浆后的红细胞(隔夜或5000rpm,5分钟离心后样品)+4C以上,标本最多存放7天.需要长期存放,可以洗涤红细胞后,放置于-80C(可存放至少3个月)27.CapillarysMinicap血红蛋白条带识别表Capillarys/Minicap区带识别表Z15:Z15:Hb HHb HZ14:/Z14:/Z13:Hb-JRovigo,HbN-Baltimore,J-KaoshiungZ13:Hb-JRovigo,HbN-Baltimore,J-KaoshiungZ12:Z12:Hb BartsHb Barts,HbProvidence
16、,HbJ-Mexico,HbJ-Baltimore.,HbProvidence,HbJ-Mexico,HbJ-Baltimore.Z11:HbKaoshiung(NewYork),denaturatedHbAZ11:HbKaoshiung(NewYork),denaturatedHbAZ10:HbHope,HbM-IwateZ10:HbHope,HbM-IwateZ9:Z9:Hb AHb A,HbCamperdown,HbPhnomPenhHbCamperdown,HbPhnomPenhZ8:AcetylatedHbF,HbAltanta,HbAthens-GAZ8:AcetylatedHbF
17、,HbAltanta,HbAthens-GAZ7Z7:Hb FHb F,denaturatedHbS,HbPorto-Allegre.denaturatedHbS,HbPorto-Allegre.Z6:Z6:Hb D-PunjabHb D-Punjab,HbPhiladelphia,HbKorle-Bu,HbLepore,HbPhiladelphia,HbKorle-Bu,HbLepore,HbKHbK ln,denaturatedHbE.ln,denaturatedHbE.Z5:Z5:Hb SHb S,HbHasharon,HbHandsworth,denaturatedHbO-Arab.,
18、HbHasharon,HbHandsworth,denaturatedHbO-Arab.Z4:Z4:Hb EHb E,denaturatedHbC,HbK,denaturatedHbC,HbK ln,HbA2variants,M-Iwateln,HbA2variants,M-IwateHbA2variantsHbA2variantsZ3:Z3:Hb A2Hb A2,HbO-ArabHbO-ArabZ2:Z2:Hb CHb C,HbConstantSpring,SetifHbA2variant,HbConstantSpring,SetifHbA2variantZ1:HbZ1:Hb A2HbA2H
19、b A2,HasharonHbA2variant,WinnipegHbA2variantA2,HasharonHbA2variant,WinnipegHbA2variant29.正常Hb A2 质控品条带结果可录为条带结果可录为QC30.Hb AFSC质控品,可用来作为参照曲线,便于异常结果的判断31.Hbs A,F,A2 检测结果可通过颜色进行区分 异常区带显示为灰色32.主要异常血红蛋白变异体Z15 HbHZ12 HbBartZ10 HbHopeZ9 Hb AZ7 Hb FZ6HbDPunjabZ5 Hb SZ4HbEZ3Hb A2Z2 Hb CHbEHbSHbH33.HbS 变异体,Hb
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