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1、干细胞工程干细胞工程干细胞工程干细胞工程.干细胞干细胞(stem cell):是具有自我更新、高度增殖和多项分是具有自我更新、高度增殖和多项分化潜能的细胞群体,是动物有机体和各种组织器官的起源细胞化潜能的细胞群体,是动物有机体和各种组织器官的起源细胞什么是干细胞什么是干细胞?.骨髓干细胞.神经干细胞神经干细胞.干细胞研究成为继人类基因组大规模测序之后最具活力、干细胞研究成为继人类基因组大规模测序之后最具活力、最有影响和最有应用前景的生命学科研究领域,最有影响和最有应用前景的生命学科研究领域,1999年干细年干细胞研究被美国科学杂志评为胞研究被美国科学杂志评为1999年度世界十大科学之冠,年度世
2、界十大科学之冠,2000年干细胞研究再次被科学杂志评为该年度世界十大年干细胞研究再次被科学杂志评为该年度世界十大科学成就之一。科学成就之一。组织工程是以干细胞研究为基础发展起来,它有望解决组织工程是以干细胞研究为基础发展起来,它有望解决临床上急需的人工组织与器官问题,进展极为迅速,已经成临床上急需的人工组织与器官问题,进展极为迅速,已经成为干细胞应用的主要方向。为干细胞应用的主要方向。.干细胞有几个主要特征干细胞有几个主要特征干细胞本身不是终末分化细胞干细胞本身不是终末分化细胞干细胞能无限增殖分裂干细胞能无限增殖分裂干细胞可连续分裂几代,也可在较长时间内处干细胞可连续分裂几代,也可在较长时间内
3、处于静止状态于静止状态干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运保保持干细胞或分化为特定细胞持干细胞或分化为特定细胞.干细胞的分类干细胞的分类按分化潜能大小来分类按分化潜能大小来分类:全能干细胞全能干细胞(Totipotent stem cell):它具有形成完整个体的它具有形成完整个体的 分化潜能。如受精卵,胚胎干细胞分化潜能。如受精卵,胚胎干细胞多多能干细胞能干细胞(pluripotent stem cell):具有分化出多种组织细具有分化出多种组织细 胞胞的潜能,的潜能,但却失去了发育成完整个体的能力,发育潜能受但却失去了发育成完整个体的能力,发育潜能受到一
4、定的限制。到一定的限制。如如骨髓多能造血干细胞是典型的例子,它骨髓多能造血干细胞是典型的例子,它可分化出至少十二种血细胞可分化出至少十二种血细胞.专能干细胞专能干细胞(multipotent stem cell):这类干细胞只能这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化,如上向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化,如上皮组织基底层干细胞、肌肉中的成肌细胞等皮组织基底层干细胞、肌肉中的成肌细胞等.根据来源来分根据来源来分:来源于胚胎来源于胚胎-胚胎干细胞胚胎干细胞 ESC (Embryonic Stem Cell)胚胎生殖细胞胚胎生殖细胞 EGC (Embryonic Germ C
5、ell)来源于成体来源于成体-成体组织来源的干细胞成体组织来源的干细胞 ASC (Adult-derived Stem Cell).根据干细胞组织发生的名称进行分类根据干细胞组织发生的名称进行分类:胎胎干细胞胎胎干细胞造血干细胞造血干细胞骨髓间质干细胞骨髓间质干细胞肌肉干细胞肌肉干细胞成骨干细胞成骨干细胞内胚层干细胞内胚层干细胞视网膜干细胞视网膜干细胞胰腺干细胞胰腺干细胞.干细胞的转分化和去分化干细胞的转分化和去分化 1干细胞的转分化:干细胞的转分化:一一种种组组织织类类型型的的干干细细胞胞在在适适当当条条件件下下分分化化为为另另一一种种组组织织类类型型的的细细胞胞的的过过程程称称干干细胞的转
6、分化。细胞的转分化。.实实验验:C57BL/6J成成年年小小鼠鼠 造造血血干干细细胞胞 WBB6F/J-KitW/KitW-V鼠鼠(亚亚致致死死剂剂量量同同位位素素照照射射)在在鼠鼠的的神经胶质细胞中检测到神经胶质细胞中检测到Y染色体染色体.即即鼠的造造血血干干细细胞胞移移植植到到鼠鼠中中分分化化为为脑星形胶质细胞。脑星形胶质细胞。移植分离3天.2干细胞去分化:干细胞去分化:一一种种干干细细胞胞向向其其前前体体细细胞胞的的逆逆向向转转化化称称干细胞去分化。干细胞去分化。实验:实验:成成体体鼠鼠造造血血干干细细胞胞 鼠鼠卵卵泡泡的的内内细细胞胞团团 表表达达胎胎鼠鼠的的珠珠蛋蛋白白基基因因参与胚
7、胎造血系统的发育。参与胚胎造血系统的发育。注入分化状态逆转.3.干细胞的可塑性干细胞的可塑性(1)干细胞的横向分化干细胞的横向分化:在在干干细细胞胞移移植植时时,供供体体干干细细胞胞在在受受体体中中通通常常分分化化为为与与其其组组织织来来源源一一致致的的细细胞胞。但但有有时时供供体体干干细细胞胞会会分分化化出出与与其其组组织织来来源源不不一一致致的的其其它它细细胞胞,这这种种现现象象称称干干细细胞胞横横向向分分化化(trans-differentiation)。.干干细细胞胞横横向向分分化化表表明明成成体体干干细细胞胞被被移移植植入入受受体体中中具具有有很很强强的的可可塑塑性性。为为干干细细胞
8、胞治治疗疗提供了可能。提供了可能。(2)实验实验:小小鼠鼠肌肌肉肉干干细细胞胞体体外外培培养养5天天少少量量骨骨髓髓间间质质细细胞胞 接接受受致致死死量量辐辐射射的的小小鼠鼠中中 各种血细胞系。各种血细胞系。植入分化.胚胎干细胞胚胎干细胞当受精卵分裂发育成囊胚时,内层细胞团的细胞即为胚胎干细胞。进一步说,胚胎干细胞(ES细胞)是一种高度未分化细胞。它具有发育的全能性,能分化出成体动物的所有组织和器官,包括生殖细胞。ES细胞的研究可追溯到上世纪五十年代,由于畸胎瘤干细胞(EC细胞)的发现开始了ES细胞的生物学研究历程。.胚胎干细胞胚胎干细胞1981年年Evans和和Kaufrnan及及Marti
9、n首次由小鼠中分离得到鼠首次由小鼠中分离得到鼠的胚胎干细胞。的胚胎干细胞。至今已分离得到的胚胎干细胞物种有:至今已分离得到的胚胎干细胞物种有:金黄地鼠(金黄地鼠(1988)、貂()、貂(1993)、猪()、猪(1994,1997)、)、鸡(鸡(1996)、恒河猴()、恒河猴(1995)、绒猴()、绒猴(1996)分离得到人的胚胎干细胞(分离得到人的胚胎干细胞(1998)分离得到人的胚胎生殖细胞(分离得到人的胚胎生殖细胞(1998).人多能人多能(pluripotent)干细胞:干细胞:James A.Thomson在 Wisconsin大学领导一个研究小组从人胚胎组织中培养出了干细胞株。方法:
10、人卵体外受精后,将胚胎培育到囊胚阶段,提取 inner cell mass细胞,建立细胞株。经测试这些细胞株的细胞表面 marker 和酶活性,证实它们就是胚胎干细胞。用这种方法,每个胚胎可取得1520个细胞用于培养。John D.Gearhart在 Johns Hopkins大学领导另一个研究小组也从人胚胎组织中建立了干细胞株。方法是:从受精后59周人工流产的胚胎中提取生殖母细胞(primordial germ cell)。由此培养的细胞株,证实具有全能干细胞的特征。.人胚胎干细胞的获得人胚胎干细胞的获得(一)获得途径:获得途径:1.从早期胚胎获得从早期胚胎获得2.2.从原始生殖细胞获得从原
11、始生殖细胞获得3.3.从移植细胞从移植细胞(克隆细胞克隆细胞)获获得得.1从早期胚胎获得从早期胚胎获得美美国国Thompson研研究究小小组组是是从从囊囊胚胚期期胚胚胎胎的内细胞团中获得胚胎干细胞的内细胞团中获得胚胎干细胞:体体外外受受精精卵卵 囊囊胚胚期期 去去除除滋养层滋养层内细胞团内细胞团 得得5株干细胞系株干细胞系 32代代(8个月个月)保持未分化状态保持未分化状态。传代培养发育免疫切除法.2从原始生殖细胞获得从原始生殖细胞获得gearhart小组:小组:流产胎儿性腺嵴流产胎儿性腺嵴 原始生殖细胞原始生殖细胞 获获得得5个个多多能能干干细细胞胞系系 7个个月月不不分分化化。思路:原始生
12、殖细胞是未分化细胞。思路:原始生殖细胞是未分化细胞。培养 分离培养.3体细胞移植体细胞移植分分化化细细胞胞核核(乳乳腺腺、皮皮肤肤细细胞胞)去去核核卵细胞卵细胞杂合细胞杂合细胞 发育成囊胚发育成囊胚 胚胎干细胞胚胎干细胞 成体成体(如多利羊如多利羊)。分离发育 移植 刺激.干细胞的体外培养干细胞的体外培养由由于于干干细细胞胞数数目目少少,应应用用时时需需先先在在体体外外进行非分化性增殖,再进行诱导分化。进行非分化性增殖,再进行诱导分化。不不同同组组织织来来源源的的干干细细胞胞的的培培养养条条件件不不尽尽相同。相同。.1 培养条件:培养条件:需要许多需要许多生长因子生长因子和和间质细胞间质细胞共
13、培养。共培养。如如Brustle等在体外培养了鼠的等在体外培养了鼠的ES细胞。细胞。分离分离ES细胞细胞 培养培养 培养培养 生长增殖生长增殖 保持分化潜能。保持分化潜能。停停止止供供给给生生长长因因子子,ES细细胞胞分分化化为为寡寡树树突突细细胞胞或或星状细胞。星状细胞。EGF培养基FGF2+PDGFFGF2培养基.2 分化诱导分化诱导在在应应用用前前还还需需依依据据靶靶组组织织类类型型对对培培养养干干细细胞进行定向分化诱导。胞进行定向分化诱导。分化诱导需了解:分化诱导需了解:干细胞发育有关的信号调节;干细胞发育有关的信号调节;干细胞发育的微环境。干细胞发育的微环境。.胚胎干细胞的分化潜能胚
14、胎干细胞的分化潜能 胚胚胎胎干干细细胞胞是是全全能能(多多能能)性性干干细细胞胞,具具有有分化为各种组织细胞的潜能。分化为各种组织细胞的潜能。.实验实验1:移植实验移植实验人人胚胚胎胎干干细细胞胞 小小鼠鼠体体内内 畸畸胎胎瘤瘤(良性良性)有三个胚层产生的组织:有三个胚层产生的组织:移植发育胃上皮胃上皮(内胚层内胚层)骨、软骨、平滑肌、横纹肌等骨、软骨、平滑肌、横纹肌等(中胚层中胚层)神经表皮、神经节复层磷状上皮等神经表皮、神经节复层磷状上皮等(外胚层外胚层).ES细胞的体外定向诱导分化细胞的体外定向诱导分化原理:选择适当的诱导剂的诱导模式,通过诱导物与细胞表面受体结合或使细胞发生轻度可逆性损
15、伤等,使被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化。.ES细胞的体外定向诱导分化细胞的体外定向诱导分化方法:经悬浮培养或悬滴培养,使ES细胞形成 EB(类胚体),再将EB消化成单细胞贴壁培养,并于不同的培养阶段添加不同种类和不同浓度的化学物质、条件培养液或细胞因子等,直接促进ES细胞定向分化为某种特殊类型的细胞,或培养条件对某些类型的细胞分化起抑制作用,从而高效诱导目的细胞的分化。.分化诱导分化诱导因素因素:化学诱导物化学诱导物(视黄酸、视黄酸、DMSO等)等)细胞因子(骨形成蛋白、视经生长因子等)细胞因子(骨形成蛋白、视经生长因子等)转录因子转录因子 (Oct-4等等).诱导分化诱导分化方法方法:单
16、层单层ES细胞诱导分化细胞诱导分化EB培养和诱导分化培养和诱导分化.ES细胞的生物学特性细胞的生物学特性 1.1.各种动物的各种动物的ESES细胞具有与早期胚胎细胞相似细胞具有与早期胚胎细胞相似的形态结构,胞体体积小,核大,有一个或几个核的形态结构,胞体体积小,核大,有一个或几个核仁。仁。2.ES 2.ES细胞与卵圆柱期(细胞与卵圆柱期(egg cylinder stage)胚胎)胚胎外胚层和胎儿生殖峙的原始生殖细胞类似,而与外胚层和胎儿生殖峙的原始生殖细胞类似,而与ICMICM细胞有差异。细胞有差异。3.3.细胞中多为常染色质,胞质结构简单,散布细胞中多为常染色质,胞质结构简单,散布着大量核
17、糖体和线粒体,核型正常,保留了整倍体着大量核糖体和线粒体,核型正常,保留了整倍体性质。正常性质。正常ESES细胞染色体正常,如发生异常则其很细胞染色体正常,如发生异常则其很难发育分化形成动物个体。难发育分化形成动物个体。.4.ES细胞在体外分化抑制培养中,呈克细胞在体外分化抑制培养中,呈克隆状生长,细胞紧密地聚集在一起,形似隆状生长,细胞紧密地聚集在一起,形似鸟巢,细胞界限不清,克隆周围有时可见鸟巢,细胞界限不清,克隆周围有时可见单个单个ES细胞和分化的扁平状上皮细胞。细胞和分化的扁平状上皮细胞。5.ES细胞增殖迅速,每细胞增殖迅速,每1824h分裂增分裂增殖殖1次。次。6.此外,其还可以在体
18、外进行选择、操此外,其还可以在体外进行选择、操作、冻存。冻存的细胞可在需要时随时解作、冻存。冻存的细胞可在需要时随时解冻,继续培养不失其原有特性,并且来自冻,继续培养不失其原有特性,并且来自一个克隆的细胞具有同样的特征一个克隆的细胞具有同样的特征。.ES细胞生物学特性细胞生物学特性细胞形态结构及核型细胞形态结构及核型细胞的高度分化潜能细胞的高度分化潜能碱性磷酸酶的表达碱性磷酸酶的表达胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达.形态和生化特征形态和生化特征 1.形形态态:细细胞胞体体积积小小,核核大大,1多多个个核核仁仁。离体培养可产生密集的多细胞克隆。离体培养可产生密集的
19、多细胞克隆。2.生化特征生化特征:端粒酶活性高端粒酶活性高。3.干细胞物理特性干细胞物理特性:如如干干细细胞胞对对Hoechst33324和和Rhodamine123染料不着色。染料不着色。.4.干干细细胞胞表表面面免免疫疫原原性性:一一般般表表达达胚胚胎胎早期的表面抗原,而且有种属差异。早期的表面抗原,而且有种属差异。如如小小鼠鼠胚胚胎胎干干细细胞胞表表达达胚胚胎胎阶阶段段性性特特异异抗抗原原-1(SSEA-1),不不表表达达SSEA-3或或SSEA-4;人胚胎干细胞表达人胚胎干细胞表达SSEA-3或或SSEA-4。.ES ES细胞的高度分化潜能细胞的高度分化潜能 ESES细胞的全能性是其区
20、别于成纤维细胞等体细胞的细胞的全能性是其区别于成纤维细胞等体细胞的显著特点:显著特点:1.1.ESES细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未细胞在体外需在饲养层细胞上培养才能维持其未分化状态,一旦脱离饲养层就自发地进行分化。分化状态,一旦脱离饲养层就自发地进行分化。2.2.在单层培养时细胞自发分化成多种细胞,在单层培养时细胞自发分化成多种细胞,悬浮培养中:悬浮培养中:“简单类胚体简单类胚体”“囊状胚体囊状胚体”细胞分化物。细胞分化物。.3.ES细胞可进行诱导分化细胞可进行诱导分化 *用用RA(维生素(维生素A酸或视黄酸)作诱导酸或视黄酸)作诱导90以以上的上的ES细胞分化为神经胶质细胞,细
21、胞分化为神经胶质细胞,*聚集培养的聚集培养的ES细胞诱导分化则可分化为有节细胞诱导分化则可分化为有节律性收缩的心肌细胞。律性收缩的心肌细胞。*将将ES细胞注射到同源动物皮下,可形成组织细胞注射到同源动物皮下,可形成组织瘤,其细胞组成可代表瘤,其细胞组成可代表3个胚层细胞。个胚层细胞。*用用ES细胞作核供体进行细胞核移植,可以得细胞作核供体进行细胞核移植,可以得到可发育重构胚和动物个体。到可发育重构胚和动物个体。.碱性磷酸酶的表达碱性磷酸酶的表达 许多资料表明,小鼠、大鼠的桑椹胚细胞和囊胚细胞均有许多资料表明,小鼠、大鼠的桑椹胚细胞和囊胚细胞均有碱性磷酸酶(碱性磷酸酶(AKP)表达,小鼠的)表达
22、,小鼠的EC细胞和细胞和ES细胞中均含细胞中均含有丰富的有丰富的AKP。而在已分化的。而在已分化的EC细胞和细胞和ES细胞中细胞中AKP呈弱呈弱阳性或阴性。猪、兔的桑椹胚和早期囊胚阳性或阴性。猪、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈阳性。因呈阳性。因此,此,AKP常用来作为鉴定常用来作为鉴定EC细胞或细胞或ES细胞分化与否的标志细胞分化与否的标志之一之一。.胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达 早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗原(早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗原(SSEA1)。在胚胎的原始外胚层细胞、)。在胚胎的原始外胚层细胞、ES细胞、细胞、EC细胞
23、和原始细胞和原始生殖细胞的表面均可检测到生殖细胞的表面均可检测到SSEA1的表达。小鼠的表达。小鼠SSEA1的表达自的表达自8一细胞期开始,直到原始外胚层形成期。早期囊胚一细胞期开始,直到原始外胚层形成期。早期囊胚ICM细胞全部呈强阳性,晚期囊胚中部分细胞全部呈强阳性,晚期囊胚中部分ICM呈强阳性,部呈强阳性,部分呈弱阳性,少部分为阴性。因此,分呈弱阳性,少部分为阴性。因此,SSEA也常作为也常作为ES细胞鉴细胞鉴定的一个标志。定的一个标志。.胚胎干细胞的鉴定胚胎干细胞的鉴定-细胞的形态结构细胞的形态结构-核型分析核型分析-碱性磷酸酶(碱性磷酸酶(AKPAKP)染色)染色-SSEA-I-SSE
24、A-I 免疫荧光标记免疫荧光标记-分化能力检测分化能力检测 体外分化试验体外分化试验 体内分化试验体内分化试验 嵌合体形成试验嵌合体形成试验 核移植试验核移植试验.ES细胞形态学鉴定细胞形态学鉴定 依依ES细胞的形态结构(胞体体积小,核大、有一个或细胞的形态结构(胞体体积小,核大、有一个或几个核仁)和生长特性(呈克隆状生长,细胞紧密聚集,几个核仁)和生长特性(呈克隆状生长,细胞紧密聚集,形似鸟巢,界限不清)对形似鸟巢,界限不清)对ES细胞进行初步鉴定。细胞进行初步鉴定。.核型分析核型分析 ES ES细胞具有正常二倍体核型,在体外培养条件下,稳定细胞细胞具有正常二倍体核型,在体外培养条件下,稳定
25、细胞系的细胞染色体数目和核型保持与来源动物品系一致,系的细胞染色体数目和核型保持与来源动物品系一致,可用核可用核型分析进行检验。型分析进行检验。.碱性磷酸酶(碱性磷酸酶(AKP)染色)染色 *常用快绿(常用快绿(Fast Green Staining)Fast Green Staining)染色法,对照以已染色法,对照以已建系建系ESES细胞(或小鼠的脱带桑椹胚或囊胚)作为阳性对照,细胞(或小鼠的脱带桑椹胚或囊胚)作为阳性对照,作用液中不含作用液中不含-萘酚磷酸钠为阴性对照。萘酚磷酸钠为阴性对照。*结果判定阳性对照结果判定阳性对照ESES细胞染成棕色,阴性对照无色。细胞染成棕色,阴性对照无色。
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