发光法测定菌体ATP含量应用.ppt
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1、发光法测定菌体ATP含量1.实验目的 2.实验原理 3.试剂 4.实验材料与仪器 5.操作步骤及结果一.实验目的 1.理解ATP的理化特性和生理功能;2.学会用荧火虫素-荧火虫素酶生物发光法定量测定ATP含量的方法;3.理解ATP生物发光原理及应用研究。二.实验原理 生物发光(bioluminescence)在希腊语中表示活着的意思,在拉丁语中表示发光、发亮的意思。目前,生物发光应用最广最主要的是荧光素-荧光素酶反应发出的荧光,荧光素酶存在于荧火虫、水母一上些细菌中,它是生物内产生的一种生物反应蛋白质。1.ATP生物发光工作原理 荧光素酶-ATP检测法,其化学反应的结果是把化学能转化为光能。细
2、胞内源性的ATP含量可以反应活细胞的数量和活性。其化学反应如下:ATP+D-L-Luciferin+O2 Oxyluciferin+AMP+ppi+O2+Light 当细胞受损或死亡时,其ATP值迅速下降或消失,基于这一原理,检测细胞内的ATP含量,即可反应细胞的存活状况,ATP浓度与活细胞数密切相关。检测时先将ATP与提取剂充分混合,使细胞壁和细胞膜裂解,释放ATP,再加入荧光素-荧光素酶,ATP在荧光素和荧光素酶的作用下,使其释放磷酸基团同理发出荧光,用生物荧光仪检测相对荧光强度(relative light units,RLU),由此测出ATP含量,进而反映活细胞数。2.ATP生物发光特
3、点优点:灵敏、快速、简便、稳定是ATP生物发光的主要优势所在,同时可以把ATP数量化,用荧光强度(RLU)把光定量,广泛应用于食品工业,医药,生物学等领域。缺点:荧光强度和菌落形成单位(CFU)之间没有直接关系,也无法对细菌的种属进行鉴定。3.应用研究检测环境是否被有害的微生物污染,食品卫生的检测和生产环境实时监测(HACCP)等。用于乳制品的检测、调味品如脱水蔬菜的细菌学的测定。新药筛选及疗效评价:广泛应用于需要进行大量快速初选工作的新药筛选中。细胞免疫活性检测应用:ATP生物发光法还可测定T细胞的免疫活性。三.试剂 1.荧光素-荧光酶试剂 将解冻后的12mlReocnstiuttoin B
4、ueffr与荧光素酶-荧光素粉剂混合,轻轻摇晃(不能振荡)使其溶解。第一次使用前在室温下放置1h,以后只需20min左右。不用时要放置在-20C下保存。取0.5ml的标准ATP试剂(10-7mol/l)到5ml的容量瓶中,加入缓冲液定容,得到10-8mol/l的标准ATP试剂。用移液管取5ml的上述标准ATP试剂到50ml的容量瓶中,加入缓冲溶液定容,得到10-9mol/l的标准ATP试剂。重复以上过程,得到10-10mol/l和10-11mol/l的标准ATP试剂。2.标准ATP试剂 3.缓冲液 以Tris-Acetate作为缓冲液。称取一定量的Tris碱,使定容后的浓度为0.05mol/l
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