DB37∕T 3893-2020 芋头病毒检测技术规程.doc
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1、ICS65.020B 16DB37山东省地方标准DB 37/T 38932020芋头病毒检测技术规程Detection and identification of taro viruses2020 - 03 - 31发布2020 - 05 - 01实施山东省市场监督管理局 发布前言本标准由山东省农业农村厅提出。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位:山东省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人:姜珊珊、辛相启、吴斌、张眉、王升吉、辛志梅。芋头病毒检测技术规程1 范围本标准规定了芋花叶病毒(Dasheen mosaic virus,DsMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumber
2、mosaic virus,CMV)的RT-PCR的检测方法。本标准适用于芋头叶片中芋花叶病毒和黄瓜花叶病毒的检测。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件,仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3 检测对象3.1 芋花叶病毒中文名:芋花叶病毒学名:Dasheen mosaic virus缩写:DsMV分类地位:马铃薯Y病毒科(Potyviridae),马铃薯Y病毒属(Potyvirus)病毒粒子、传播途径及危害:病毒粒子呈线状,长度约为750 nm。一般通
3、过蚜虫传播,还可通过机械摩擦传播。感染DsMV的芋头植株通常表现为叶片花叶、斑驳、皱缩卷曲、叶脉黄化和茎坏死等症状。3.2 黄瓜花叶病毒。中文名:黄瓜花叶病毒学名:Cucumber mosaic virus缩写:CMV分类地位:雀麦花叶病毒科(Bromoviridae),黄瓜花叶病毒属(Cucumovirus)病毒粒子、传播途径及危害:病毒粒子为球状,直径28 nm30 nm。主要由蚜虫以非持久性方式传播。导致寄主出现花叶、黄化、皱缩等症状。4 主要仪器设备、用具和试剂4.1 仪器设备和用具仪器设备和用具主要有:a) PCR仪;b) 电泳仪;c) 水平电泳槽;d) 凝胶成像仪;e) 高速冷冻台
4、式离心机;f) 纯水仪;g) 万分之一天平;h) 普通冰箱(04);i) -20低温冰箱;j) -70低温冰箱;k) 磁力搅拌器;l) 高压灭菌锅;m) 可调微量移液器(10 L、100 L、200 L、1000 L、5000 L);n) RNase-free吸头(10 L、200 L、1000 L);o) RNase-free离心管(1.5 mL、2.0 mL);p) RNase-free PCR反应管。4.2 试剂所有实验用试剂均为分析纯;相关试剂配制方法详见附录A;除特殊说明外,均为符合GB/T 6682,实验用水为无菌超纯水或去离子水。4.2.1 RNA提取试剂:a) 多糖多酚植物RN
5、A提取试剂盒或其他等效产品;b) 三氯甲烷;c) 异丙醇;d) 75%乙醇;e) RNase-free超纯水。4.2.2 反转录试剂:a) 随机引物;b) RNase抑制剂;c) 逆转录酶:AMV或其他等效酶;d) dNTPs(10 mM);e) -20C贮藏。4.2.3 PCR试剂:a) DNA聚合酶试剂盒:2Es Taq MasterMix或其他等效产品; b) DNA分子量标记物:100 bp2000 bp;50TAE缓冲液;c) 核酸染料:Gelred(10000)溶液或其他等效溶液;d) 含10-4倍浓度 Gelred的1%琼脂糖凝胶;e) 6DNA上样缓冲液。5 RT-PCR检测方
6、法5.1 方法提要芋花叶病毒和黄瓜花叶病毒皆为RNA病毒,利用TransZol Plant多糖多酚植物RNA提取试剂盒进行RNA纯化,然后进行RT-PCR检测,通过琼脂糖凝胶电泳对检测结果进行判定。5.2 样品采集观察芋头叶片是否出现叶脉褪绿、脉间褪绿黄化、叶片皱缩、花叶、叶片畸形等典型病毒病症状,取出现上述症状的样品装至无菌样品袋中,标记样品编号、取样时间、取样地点,于低温条件下(28)运送至实验室,放置-70超低温冰箱保存备用。样品避免反复冻融。以通过分子检测不含病毒的样品作为阴性对照,以确定感染DsMV或CMV的样品为阳性对照。以下操作对阴性对照、阳性对照进行同样处理。5.3 RNA的提
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