基因工程知识点.pdf
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1、基因工程期末考点基因工程期末考点1.格里菲斯实验:格里菲斯实验:用粗糙型(R,无毒)和光滑性(S,有毒)肺炎链球菌注射小鼠,用R 单独注射时,小鼠存活;S 则小鼠死亡;高温加热杀死的 S 则存活;R+高温加热杀死的 S 菌株混合注射,小鼠死亡:S 型菌种含有某种转化因子将 R 转变为 S,导致小鼠死亡2.艾弗里实验(体外转化实验):艾弗里实验(体外转化实验):分离出蛋白质、脂类、多糖和 DNA,转入到小鼠体内,初步证明 DNA 是遗传物质,但是存在争议(DNA 和蛋白质未完全分离)3.Alfred Hershey、Martha Chase(译赫尔希、蔡司)噬菌体侵染实验,噬菌体侵染实验,证明
2、DNA 是遗传物质4.Waston、Crick、威尔金斯、富兰克林 DNADNA 双螺旋模型双螺旋模型5.Matthew Meselson、Franklin Stahl DNADNA 半保留复制半保留复制6.Marshall W.Nirenberg、Har G.Khorana、Robert W.Holley 密码子破译密码子破译7.镰刀型贫血症:血红蛋白第六位氨基酸由谷氨酸突变为缬氨酸8.胰岛素:加拿大科学家 Banting、Best、科利普、麦克莱德发现,是糖尿病治疗史上的里程碑(LiLy 公司)9.Stanley Cohen(斯坦福大学)+Herbert Boyer(加州大学)重组 DNA
3、 技术,基因重组得人胰岛素(礼来和诺和诺德公司)10.1990 年,第一例临床基因治疗 患者为四岁女孩 Ashanti de Silva,缺乏腺苷脱氢酶ADA 基因而患有严重综合性免疫缺陷症,研究者 W.F.Anderson 将 ADA 基因导入患者淋巴细胞,再将改造后的淋巴细胞回输到患者体内11.HIV 唯一治愈病人 柏林病人 Timothy Ray Brown(同时患 HIV 和白血病,CCR5 受体)12.基因编辑技术:Zinc Finger;TALEN;CRISPR 1.1.基因操作工具酶:基因操作工具酶:酶在 DNA 分子水平的操作中,依赖于一些重要的酶,如限制性核酸内切酶、连接酶等
4、,作为工具对 DNA 进行切割和拼接,这些酶统称为基因工程工具2.2.内切酶:内切酶:在 DNA 上核苷酸的特定连接处以特定的方式把 DNA 双链切开的工具酶酶,如EcoRI,HpaI。3.DNA3.DNA 聚合酶:聚合酶:以 DNA 为模板,沿 53方向将游离脱氧核苷酸不断连接到正在合成的新 DNA 链上的 DNA 合成酶。4.DNA4.DNA 连接酶(了解):连接酶(了解):催化 DNA 上裂口两侧(相邻)核苷酸裸露的 3羟基和 5磷酸之间形成共价结合的磷酸二酯键,使断开的 DNA裂口连接起来的工具酶(通常使用来自 T4 噬菌体的 DNA 连接酶和大肠杆菌连接酶;前者以 ATP 作为辅助因
5、子,后者需要 NAD作为能源;二者都能连接平末端和黏性末端;T4 DNA 连接酶应用更广泛一些)5.鉴于对核酸的不同作用,将相关酶分为核酸水解酶类核酸水解酶类(核酸内切酶、核酸外切酶)、核核酸合成酶类酸合成酶类(DNA 聚合酶、RNA 聚合酶、DNA 连接酶)以及核酸修饰酶类核酸修饰酶类(甲基化酶、核苷酸激酶、核苷酸转移酶、磷酸酶)6.常用工具酶及其功能7限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶:是指能识别双链 DNA 分子内部特异位点并在识别位点或附近水解磷酸二酯键的一类内切核酸酶,简称为限制酶。(一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并在特定的切割点上将 DNA 分子切断)作用特点:作用特点:1
6、)专一性()专一性(一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并且能在特定的切点上切割 DNA 分子);2)多样性(多样性(限制酶有 200 多种);3)限制酶识别的特定序列通常是由 4-6 个碱基对组成的具有回文序列的 DNA 片段,并在识别序列内或其附近水解 DNA 链中的磷酸二酯键;4)不同酶识别的碱基数目不同,一般为 4、5、6 个碱基对;5)识别序列碱基对越多,则这种酶在 DNA 上出现的频率越低;6)不同生物其碱基含量不同,酶识别位点的分布及频率也不同;7)大多数限制酶是错位切割双链 DNA 产生 5或 3粘性末端能在特异位点(酶切位点)上催化双链 DNA 分子的断裂,产生相应的限制
7、性 DNA 片段。作用结果:作用结果:产生黏性末端或平末端 分类:分类:限制酶主要分布在微生物中,分为三类:即 I 型、II 型、III 型酶。I 型和 III 型酶在同一蛋白酶分子中兼有甲基化酶及限制性内切核酸酶活性,又因其识别位点与切割位点不固定,所以价值不大;II 型酶切割 DNA 片断活性和甲基化作用是分开的,且核酸内切作用又具有序列特异性,识别、切割特殊的回文序列,在基因克隆中广泛使用。(通常所用的限制性核酸内切酶都是指 II 型)8.8.粘性末端:粘性末端:被限制酶切开的 DNA 两条单链的切口,带有几个伸出的核苷酸,它们之间正好互补配对,这样的切口叫做黏性末端平末端:平末端:部分
8、限制酶沿识别序列内的对称轴上切割 DNA 双链,产生平末端限制性内切酶酶切产生两种结果(粘性末端和平末端)/三种结果(5、3粘性末端和平末端),粘性末端效率高9.9.命名(了解)命名(了解)采用 Smith 和 Athens 提议的方案,根据限制性内切核酸酶来源和菌株进行命名 用来源细菌的英文缩写斜体符号命名:它的第一个字母大写,来源细菌属名的第 1 个字母;第二、三字母小写,来源细菌种名的头 2 个字母;第四个字母代表菌株;最后用罗马字母表示同一菌株中不同限制酶的编号(如 Hind III,H 为属名第一个字母 in 为种名头两个字母 d 为菌株名 Rd 中的 d,III 说明是在该菌株中发
9、现的第三种限制性核酸内切酶)10.同尾酶:同尾酶:来源不同、识别序列不同但可以产生相同粘性末端的酶称为同尾酶(BamH I和 Bgl II Sal I 和 Xho I)同位酶:同位酶:识别相同序列但切割位点不一样的限制性核酸内切酶(相同序列不同末端 SmaI和 XmaI)11.11.影响内切酶酶切反应的条件(简答题)影响内切酶酶切反应的条件(简答题)温度:一般 37 盐离子浓度:Na,Mg2 缓冲体系:具有稳定 pH 环境的 Tris-HCl 缓冲体系 DTT(二硫苏糖醇)用于保持酶稳定性和活性 反应体积和甘油浓度:商品化的限制性内切核酸酶均加 50甘油作为保护剂,一般在-20保存。酶切反应时
10、,加酶的体积一般不超过总反应的 10,否则甘油浓度过高,影响酶切反应 反应时间:通常为 1h;进行大量 DNA 酶切反应时一般让酶解过夜 DNA 纯度和结构:一个酶单位定义:1h 内完全酶解 1g 噬菌体 DNA 所需的酶量 DNA 样品中所含的蛋白质、有机溶剂、RNA 等杂质会影响酶切反应的速度和完全程度 酶切的底物一般为双链 DNA,DNA 的甲基化位置会影响酶切反应12.“星星”活性活性:酶特异性改变或特异性降低而呈现的活性(非特异性切割)13.DNA 连接酶连接的部位是磷酸二酯键(梯子的扶手),其作用过程分为 3 步:(简答题)连接酶与辅助因子 ATP 或 NAD形成酶-AMP 复合物
11、AMP 作用于 DNA 缺口的 5-末端磷酸基团缺口 3-OH 对活跃的磷原子作亲核攻击,形成新的磷酸二酯键,封闭切口13.DNA 连接酶的反应条件 连接反应的温度连接反应的温度是影响转化效率的最重要参数。多数内切酶产生的粘性末端的 Tm 值在15以下,然而保持连接酶活性的最佳反应温度却是 37,但在该温度下粘性末端之间的氢键结合是不稳定的,因此最适温度是粘性末端的 Tm 值和连接酶最适温度的折中,所以连接反应一般采用 1616过夜过夜 DNADNA 浓度:浓度:外源片段浓度比载体 DNA 浓度高 10-20 倍;由于平末端的连接效率比粘性末端要低得多,故在平末端连接反应中,T4 DNA 连接
12、酶的浓度和外源 DNA 及载体 DNA浓度均要求较高 防止环化:防止环化:碱性磷酸酶预先处理质粒载体 时间:时间:过夜最好14.平末端 DNA 片段的连接直接用 T4 DNA 连接酶连接:效率不高,较少采用同聚物同聚物连接平末端 DNA 片段:先用末端核苷酸转移酶,给平末端 DNA 分子加上同聚物尾巴后再用 DNA 连接酶进行连接用衔接物衔接物连接平末端 DNA 分子:目的是在平末端分子上构建限制性核酸内切酶酶切位点,经酶切后产生特异的粘性末端,从而与具有互补末端的 DNA 连接(衔接物:指用化学方法合成的一段由若干个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的寡核苷酸片段)15.重组 DNA
13、实验的一般程序 选用一种对载体 DNA 只具唯一限制识别位点的限制酶(如 EcoR I)作位点特异的切割,形成全长的具粘性末端的线性 DNA 分子 再将外源 DNA 片段也用同一种酶作相同的消化 混合,加入 DNA 连接酶。由于具有相同的(如 EcoR I)粘性末端,能退火形成双链结合体。其中单链缺口经 DNA 连接酶封闭之后,便产生稳定的杂种 DNA 分子16.逆转录酶:亦称为反转录酶,是依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶,以 RNA 为模板指导三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)合成互补 DNA 链(cDNA)的酶。17.碱性磷酸酶功能功能:催化去除 DNA、RNA、rNTP 和 dNTP 上的
14、5端磷酸基团,以防发生自身连接 用途:用途:在用-P32 磷酸和多核苷酸激酶在 5端标记 DNA 或 RNA 之前,进行碱性磷酸酶处理;在 DNA 连接之前常用它处理克隆载体以防止载体自身连接18.其他功能酶(了解)磷酸激酶:对核酸末端羟基进行磷酸化的酶 作用:作用:放射性标记 DNA 链 5末端,探针标记 Maxam-Gilbert 化学法的 DNA 序列分析 使缺少 5磷酸的 DNA 片段和合成接头磷酸化 特性:特性:很难纯化,酶制品常不纯;铵离子是该酶的强烈抑制剂;低浓度的磷酸也可抑制该酶的活性末端脱氧核苷酸转移酶:来自小牛胸腺 作用:在一定条件下,催化将一个一个的脱氧核苷酸,沿着 53
15、加到 DNA 链的 3-OH 末端。该过程不需要 DNA 模板,对双链、单链 DNA 都适用。经常用于人工粘性末端的构建甲基化酶:能识别限制酶识别的序列,识别顺序中的某个碱基发生甲基化(常见使限制酶识别序列中的 C 或 A 甲基化修饰),属修饰酶类。经修饰的 DNA 不再被限制酶降解;细胞的限制一修饰系统中的修饰作用是由甲基化酶(methylase)来完成的。甲基化酶同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序,真核生物中目前只发现 5 甲基胞嘧啶(m5c)1 12.2.载体载体 :携带目的基因进入宿主细胞进行复制、扩增和表达的工具称载体(Vector);即用于克隆、运载和转移目的基因并能自我复制的
16、DNA 分子载体三元件:载体三元件:能在宿主细胞中复制并稳定地保存-具复制原点复制原点(ori)(ori):在宿主细胞中不仅能独立地自我复制,而且能与携带的外源 DNA 一起复制 能与目的基因连接-具多个限具多个限制酶切点制酶切点,而每一个这样的酶切位点在载体 DNA 中只有一个(广泛、特异)便于筛选鉴定-具有标记基因标记基因,这种选择标记基因通常是抗菌素基因或某种酶基因,而宿主细胞并不具有按作用分:按作用分:将载体分为克隆载体克隆载体(可以克隆和运载目的基因并转移到宿主细胞中进行复制和扩增)、表达载体表达载体(克隆、运载和转移目的基因到受体细胞中进行复制和扩增)和穿梭穿梭载体载体(能在两种不
17、同的生物中复制的载体,既能在原核生物又能在真核生物复制)3.各种 DNA 载体比较(master)4.4.质粒质粒 :质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、能自我复制、易分离和导入的环状双链 DNA 分子。(质粒是基因工程中最常用的运载体,而最常用的质粒的是大肠杆菌的质粒)质粒载体的修饰改造:质粒载体的修饰改造:去掉不必要的 DNA 区域,只保留质粒复制必须部分,以提高外源DNA 装载量 减少质粒内限制性内切酶位点,质粒酶切位点过多,给克隆外源 DNA 造成不便 加入选择性标记:通过质粒间的重组使质粒携带合适标记,常用的有抗生素抗性标记。如:氨苄青霉素抗性标记、四环素抗性标记、卡那霉素
18、抗性标记等 安全性能改造:不能随便转移,以免污染环境 改造或增加基因表达的调控序列:比如加入强启动子发展概况(了解):第一阶段发展概况(了解):第一阶段(1977 年前):天然质粒和重组质粒的利用,如 pSC101,colE1,pCR,pBR313 和 pBR322 第二阶段第二阶段:增大载体容量(降低载体长度),建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如 pUC 系列载体 第三阶段第三阶段:完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求,如 M13mp 系列载体,含 T3,T7,sp6 启动子载体,表达型载体及各种探针型载体(pBR322pBR322 载体载体:分子量小、拷贝数高、含四环素和氨苄青霉
19、素两种抗生素抗性基因作为选择标记、对多种常见的限制性核算内切酶仅有一个切割位点pUCpUC 质粒系列质粒系列:Puc18/19 为代表,以 pBR322 为基础,去除包括四环素在内的 40%DNA,换用了 M13 噬菌体的一个片段,内含有 lacZ 的 5序列以表达半乳糖苷酶的 片段,lacZ的上游包括乳糖操纵子上的启动子 P 和操纵基因 O);具有一个改进的 pMB1 复制子且有很高的拷贝数,保留氨苄青霉素抗性基因作为筛选标记,双功能检测质粒载体(青霉素抗性基因+蓝白斑筛选)分子量更小;拷贝数更高;多克隆位点 MCS 由人工合成的多个单一酶切位点构成5.5.蓝白斑筛选原理:蓝白斑筛选原理:p
20、UC18/pUC19 上含有一个 LacZ 基因的调控序列和编码-半乳糖苷酶N 端 146 个氨基酸的序列(-互补肽)的 DNA 序列(标记为 lacZ),多克隆位点就存在于 lacZ上;-半乳糖苷酶的 C 端编码基因却位于相应的宿主菌上;当这两个部分基因产物(缺陷型-半乳糖苷酶)结合才会形成一个有活性的-半乳糖苷酶。这种机制称为-互补作用。X-gal 是-半乳糖苷酶的指示剂,在诱导物 IPTG(乳糖类似物,效应物)存在下,-半乳糖苷酶催化 X-gal 形成蓝色化合物,导致菌落呈现蓝色;而当多克隆位点成功插入目的基因,则 lacZ被破坏,无法合成-互补肽与宿主合成的相应片段互补形成具有活性的-
21、半乳糖苷酶,就无法与底物 X-gal 发生反应产生蓝色颜色反应,所以对应的菌落应该为白色。所以基因工程实验中,白色菌落为重组子,蓝色菌落是空载体转化子6.6.噬菌体载体:噬菌体载体:1 1)噬菌体分类:)噬菌体分类:根据与宿主的关系,可分为烈性烈性和温和噬菌体温和噬菌体(烈性噬菌体仅有溶菌生长周期;温和噬菌体既能进入溶菌生长周期,又能在感染过程中不产生子代噬菌体颗粒,噬菌体 DNA 整合到寄主细胞染色体 DNA 上,即进入溶源生长周期。噬菌体载体与质粒载体比较结构更加复杂,但感染细胞更为有效)2)噬菌体是一种温和噬菌体,遗传结构研究比较清楚,且装载量较质粒大,可以用来构建基因文库。入侵大肠杆菌
22、后可以按裂解裂解或溶源溶源两种方式生存和繁殖(噬菌体在宿主内进行独立复制,在 1 个菌体内生长出 100 个左右的新噬菌体,并冲破(杀死)细菌释放出来,再度感染其它活菌,称为溶菌溶菌 噬菌体侵入菌体后,把自身 DNA 加进细菌 DNA里(整合),作为细菌基因的一部分,随菌的细胞分裂而增殖,这种生活状态称为溶源溶源3 3)热启动:)热启动:噬菌体从溶原状态转变为裂解状态时一种可诱导过程,实验室常用的是热热诱导。诱导。低温时(30)建立溶原,高温(42)则出现裂解。噬菌体的 c1 基因是温度敏感突变型的,称为 c1ts。c1ts 可作为组件插入质粒 DNA 内,目的基因插入在其下游,重组体的目的基
23、因在 42表达,30不表达。这种方法称为热诱导表达,使用的是温敏开关4 4)噬菌体载体分类)噬菌体载体分类:插入型载体插入型载体和替换型载体替换型载体(插入型仅有一个可供外源 DNA 插入的克隆位点;替换型具有两个对应的酶切克隆位点)5 5)噬菌体构建:噬菌体构建:相较于野生型 噬菌体 DNA,人工构建的 DNA 缩短了自身的长度缩短了自身的长度,增大了装载量;删除或诱变重复的酶切口删除或诱变重复的酶切口,防止重复的酶切口影响后续外源 DNA 的组装;加加装了选择标记装了选择标记,如蓝白斑筛选的 lacZ6 6)DNADNA 作为载体的优点作为载体的优点1).DNA 可在体外包装成噬菌体颗粒,
24、能高效感染大肠杆菌 2).DNA 作为载体,其装载外源 DNA 的能力可达 25kb,远远大于质粒的装载量 3).它既可作为克隆载体,也可作为表达载体,在基因库筛选中,噬菌体作载体与细菌质粒相比,具有易操作、阳性克隆数多等特点,现广泛用于各类基因库的构建7.7.柯斯质粒载体柯斯质粒载体 :柯斯质粒(Cosmid)载体又叫粘粒载体,这是一种由人工构建的含有 噬菌体 DNA 的 cos 位点和质粒复制子的特殊类型的杂和质粒载体,具有质粒和噬菌体的双重特征,被称为 cosmid,指带有粘性末端位点的质粒。(柯斯质粒在结构组成上具有 噬菌体的特性,也具有质粒载体的特性和高容量的克隆能力,一般可插入 3
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