细菌感染的病原学诊疗.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,细菌感染的病原学诊疗,（一）标本的采集,要求：,1.早期采集：尽量在发病早期、应用抗生素之前采集,2.根据标本的种类及可能的目的菌的特性选择不同的标本采集方法,3.无菌采集：严格无菌操作，采集后标本置于无菌容器，且不得接触任何抗菌物质和消毒剂,4.标本采集要足量,5.安全采集,一、临床标本的采集与处理原则,（二）标本的运送、保存与处理,标本采集后应尽快送检，厌氧菌必须在2h内送检。,1,.床边接种,2,.置于保存液或转运培养基中送检,3,.针对可能存在的病原体的特点对标本进行冷藏、保温或保持厌氧状态进行送检,4,.,标本送检过程中应注意安全,不染色标本检查法,染色标本检查法,二、细菌的形态学检查,主要用于观察细菌的动力及其运动状态,1.悬滴法,2.压滴法,3.毛细管法,4.暗视野显微镜,检查,法,5.相差显微镜,检查法,（一）不染色细菌标本的检查,细菌染色标本的制作程序,涂片 干燥 固定 染色,（二）细菌染色标本的检查,（1）单染色法 只用一种染料色的方法,制片结晶紫1min水洗晾干、油镜检,（2）复染色法,革兰染色法（Gram stain）,抗酸染色法（acid-fast stain）,（3）特殊结构染色法,3.细菌常用的染色方法,革兰染色法（Gram stain）,方法（改良快速法）,初染：结晶紫等量,NaHCO,3,3,5s,，,水洗,媒染：碱性碘液,3,5s,，,水洗,脱色：丙酮酒精,3,5s,，,水洗,复染：碱性稀释复红,3,5s,，,水洗,结果,紫色：革兰阳性菌,红色：革兰阴性菌,原理,方法,（,Ziehl,Neelsen,染色法）,初染：,5,石碳酸复红 加温,染,3,5min,，水洗,脱色：,3%,盐酸酒精,1 min,，水洗,复染：碱性美兰,1 min,，,水洗,抗酸染色法（acid-fast stain）,结果,红色：抗酸性细菌,蓝色：非抗酸性细菌,注意事项,一张玻片只能涂染一份标本,不能使用染色缸,染色关键：脱色时间的长短,特殊结构染色法,荚膜染色（capsule stain）,芽胞染色（spore stain）,鞭毛染色（,flagellum,stain）,细菌的接种与分离培养技术,一、培养基（culture medium）,（一）定义,用人工方法将适合细菌生长需要的各种营养物质配制成的混合营养制品。,营养物质,氮源、碳源、无机盐类、生长因子等,凝固物质,琼脂、明胶、卵白蛋白等,抑制剂,抗生素、化学物质、染料等,指示剂,酚红、溴甲酚紫、中性红等,（二）培养基的组成成分,按用途分类,基础培养,基（basic medium）牛肉汤、普通琼脂平板,营养培养基（nutrient medium）血琼脂平板、巧克力血平板,鉴别培养基(differential medium)糖发酵管、KIA、MIU,选择培养基（selective medium）SS琼脂、麦康凯琼脂,特殊培养基（special medium）厌氧菌培养基、细菌L型培养基,（三）培养基的种类,按物理性状分类,固体（平板、斜面、高层）,半固体,液体,（一）接种工具,接种环与接种针,二、细菌的接种与分离技术,（二）细菌的接种方法,1.平板划线分离法,用于细菌标本的分离纯化。,2.琼脂斜面接种法,主要用于单个菌落的纯培养及保存菌种，也可用于某些生化鉴定试验的接种。,3.穿刺接种法,用于半固体培养基或KIA、明胶等具有高层的培养基接种。,半固体培养基的穿刺接种可用于观察细菌的动力。,用于各种液体培养基如肉汤、蛋白胨水、糖发酵管等的接种。,4.,液体接种法,5.倾注平板法,细菌定量培养,6.涂布法,L,棒涂布。,增菌培养、活菌计数、药敏试验等。,四、细菌的培养方法,1.需氧培养（普通培养）,需氧菌或兼性厌氧菌在有氧条件下进行的培养,普通,孵育箱,37,C,1824h,观察培养结果,平板,已接种好的 斜面,试管,少数生长缓慢的细菌需要培养,37d,直至,1,个月才能生长。,2.二氧化碳培养,将已接种培养基置于5%10%CO,2,环境中进行培养的方法。,（2）烛缸培养：简单易行，不需特殊设备，尤其适用于基层实验室。,（1）二氧化碳培养箱：能自动调节CO,2,的含量、温度和湿度。,3.厌氧培养,厌氧菌对O,2,敏感，培养过程中需造成低氧化还原电势的厌氧环境。,物理法、化学法、生物法。,厌氧罐培养法、气袋法、厌氧手套箱法、需氧菌共生厌氧法等。,五、细菌的生长现象,细菌的菌落特征:,菌落大小,形状（露滴状、圆形、菜花样、不规则等）,高度（突起、扁平或凹陷）,边缘（整齐、波形、锯齿状、卷发状等）,表面（光滑、粗糙等）,湿润度（干燥、湿润等）,透明度（不透明、半透明、透明等）,颜色（红色、灰白色、黑色、绿色、黄色或无色等）,溶血性（溶血、溶血或溶血）,特殊气味,半固体观察,动力阴性,动力阳性,表面菌膜生长,均匀混浊生长,沉淀生长,细菌在液体培养基中的生长现象,细菌的生化反应,不同细菌具有不同的酶系统，对糖和蛋白质的分解能力不同，因而其代谢产物也各异。据此可利用生物化学方法检测这些代谢产物以区别和鉴定不同细菌。,原理,1.,糖（醇、苷）类发酵试验,一、碳水化合物代谢试验,用途,糖发酵试验是鉴定细菌最常用的生化反应，特别用于肠杆菌科细菌的鉴定。,2.氧化/发酵试验（OF试验）,又称葡萄糖代谢类型鉴别试验或 Hugh-Leifson（HL）试验,分解葡萄糖,氧化型,分解葡萄糖 发酵型,不分解葡萄糖 产碱型,有氧,有氧或无氧,有氧或无氧,细菌,原理,产碱型 发酵型 氧化型,用途,主要用于革兰阴性杆菌的鉴别。肠杆菌科细菌均为发酵型，非发酵菌通常为氧化型或产碱型。,葡萄球菌和微球菌的鉴别，前者为发酵型，后者为氧化型。,阳性 培养基变黑,阴性 培养基不变色,用途,主要用于,D,群链球菌与其他链球菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。也可用于肠杆菌科、其他革兰阴性菌及厌氧菌的鉴别。,3.七叶苷水解试验,4.甲基红（MR）试验,细菌,葡萄糖,丙酮酸,醇、酮、醛等 培养基 pH5.4,甲酸、乙酸、乳酸等 培养基 pH4.4,甲基红指示剂 pH4.5 变为红色,pH5.4 变为黄色,用途,主要用于大肠埃希菌和产气肠杆菌的鉴别，前者阳性，后者阴性。,原理,5.VP试验,细菌,脱羧,KOH,-2H,二乙酰,胍基,红色化合物,葡萄糖,乙酰甲基甲醇 CO,2,丙酮酸,用途,本试验常与,MR,试验一起使用，通常两者结果相反。,MR VP,大肠埃希菌 ,产气肠杆菌 ,二、蛋白质和氨基酸的代谢试验,1.吲哚试验（靛基质试验）,原理,色氨酸 吲哚（靛基质）,细菌,对二甲氨基苯甲醛,（柯氏试剂）,玫瑰吲哚,（红色）,用途,主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。,2.硫化氢试验,原理,含硫氨基酸,细菌,硫化氢,Fe,2+（,或Pb,2+,）,FeS（PbS）,（黑色）,用途,常用于肠杆菌科菌属间的鉴定。,3.尿素酶试验,原理,NH,2,OC 2H,2,O (NH,4,),2,CO,3,2NH,3,CO,2,H,2,O,NH,2,细菌（脲酶）,（尿素）,（碳酸铵）,（培养基pH）,用途,主要用于肠道杆菌科的鉴定。变形杆菌属为。,4.苯丙氨酸脱氨酶试验,原理,苯丙氨酸 苯丙酮酸NH,3,细菌（苯丙氨酸脱氨酶）,Fe,+,绿色化合物,用途,主要用于肠杆菌科的鉴定。,三、碳源和氮源利用试验,枸橼酸盐利用试验,原理,某些细菌能利用枸橼酸钠作为唯一碳源获得能量，并利用铵盐作为唯一氮源，因而能在枸橼酸盐培养基上生长，分解枸橼酸盐生成碳酸钠和氨，使培养基变为碱性。,结果,培养基变蓝为阳性，不变色为阴性。,用途,用于肠杆菌科中各菌属间的鉴别。,IMViC,试验,I 吲哚试验,M MR试验,V VP试验,C 枸橼酸盐利用试验,用于肠道杆菌的鉴定,I MR VP C,大肠埃希菌 ,产气肠杆菌 +,四、呼吸酶类试验,1.氧化酶试验,原理,还原型细胞色素C 氧化型细胞色素C,细菌（细胞色素氧化酶）,对苯二胺,醌类化合物,（Wurster氏蓝）,试剂,1%,盐酸四甲基对苯二胺 或,1%,盐酸二甲基对苯二胺试剂,结果,细菌10s内呈深紫色（或深蓝色）为阳性，不变色为阴性。,四甲基对苯二胺,二甲基对苯二胺,用途,（1）革兰阴性杆菌的鉴定：肠杆菌科均呈阴性，大多数非发酵菌呈阳性。,（2）奈瑟菌属的鉴定：奈瑟菌属为阳性。,注意事项,试验时避免接触含铁物质，不能用接种环取菌。,2.,过氧化氢酶试验（,触酶试验）,原理,细菌（过氧化氢酶）,2H,2,O,2,2H,2,OO,2,用途,常用于革兰阳性球菌的初步分群。葡萄球菌属和微球菌属为阳性，链球菌属和肠球菌为阴性。,五、抑菌试验,1.杆菌肽试验,原理,A,群溶血性链球菌对杆菌肽几乎,100%,敏感，而其它链球菌对杆菌肽通常耐药。,用途,鉴别,A,群和非,A,群链球菌的重要试验，,A,群链球菌为阳性，其他群链球菌为阴性。,2.奥普托欣（Optochin）敏感试验,原理,Optochin(,乙基氢化羟基奎宁,),能干扰肺炎链球菌叶酸合成，抑制该菌的生长，故肺炎链球菌对,Optochin,敏感，而其它链球菌对其耐药。,用途,用于肺炎链球菌和甲型链球菌的鉴别。,肺炎链球菌,为阳性，甲型链球菌为阴性。,六、其他生化试验,1.凝固酶试验,原理,致病性葡萄球菌可产生两种凝固酶：结合凝固酶（或凝聚因子）和游离凝固酶。,游离凝固酶 凝血酶样物质,（凝血酶原）,协同因子,纤维蛋白原,纤维蛋白 （试管法）,结合凝固酶,纤维蛋白 （玻片法）,纤维蛋白原,结果,玻片法：对照侧无凝集颗粒,血浆侧出现明显凝集颗粒,阳性,用途,用于葡萄球菌的鉴定，常作为鉴定葡萄球菌致病性的重要指标。,试管法：,血浆凝固、不流动 阳性,2.胆汁溶菌试验,原理,胆盐或胆汁能溶解肺炎链球菌。,用途,主要用于肺炎链球菌与草绿色链球菌的鉴别。肺炎链球菌阳性，草绿色链球菌阴性。,血清学试验,血清学检测的原理,：,未知,已知 血清学鉴定（确诊，细菌定种、定型）,已知,未知,血清学诊断（协助诊断）,Ag Ab,Ag-Ab,1.表面抗原 荚膜多糖抗原 K抗原 Vi抗原,2.菌体抗原（O抗原）,3.鞭毛抗原（H抗原）,4.菌毛抗原 目前尚未用于细菌鉴定,特异性抗原,：细菌鉴定与分群（型）的主要依据,类属抗原或共同抗原,：非特异性交叉反应的原因,细菌的抗原物质：,1.玻片凝集试验,原理,用,诊断血清（已知抗体）在载玻片上直接与待检菌混合，若有相应细菌，则可出现肉眼可见的凝集颗粒，借以鉴定细菌。,方法,细菌,诊断血清,生理盐水,混匀,13min,观察结果,（一）凝集反应,一、血清学鉴定,结果,阳性试验侧出现凝集颗粒，对照侧均匀混浊；,阴性试验侧与对照侧均为均匀混浊；,自凝试验侧及对照侧均出现凝集颗粒。,用途,用于鉴定菌种及菌型。,评价,本法简便、快速、特异性强，是鉴定细菌最常用的方法。,2.反相间接凝集试验,原理,已知Ab颗粒性载体,Ag 颗粒凝集,（致敏颗粒）（未知）,方法,常用方法有反相间接红细胞凝集试验和胶乳凝集试验。,评价,敏感性高且易于观察结果，是一种敏感快速的方法。可用于检测微量抗原,。,（二）荚膜肿胀试验,原理,当特异性抗血清与相应细菌的荚膜抗原特异性结合，形成复合物时，可使细菌荚膜显著增大，呈肿胀现象。,方法,待检菌抗血清染料,待检菌正常兔血清染料,室温,510min,镜检,结果,阳性,在红色细菌周围可见厚薄不等、边界清晰的无色环状物，而在对照侧无此现象；,阴性,试验侧与对照侧均不产生无色环状物。,应用,本试验常用于肺炎链球菌、肺炎克雷伯菌、流感嗜血杆菌、炭疽芽胞杆菌的检测及分型。,（三）制动试验,原理,抗鞭毛抗体与鞭毛抗原结合，使鞭毛强直、相互粘着而失去动力，细菌运动停止。,方法,抗血清,室温 510min,悬滴观察细菌运动,悬滴观察细菌运动,菌悬液,结果,阳性 细菌运动停止，菌体凝集成块,阴性 细菌运动无改变,注意事项,抗血清中不能加防腐剂。,应用,常用于运动活泼细菌的快速鉴定，如霍乱弧菌的鉴定。,二、血清学诊断,用已知抗原检测病人血清中的相应抗体，以诊断感染性疾病的方法。,用途,作为某些传染病的辅助诊断，尤其对某些病原体不能培养或难于培养的感染性疾病，可以提供诊断依据。,血清学诊断主要适用于病程较长的传染病的诊断。,结果判断,一般作血清学诊断时，需取患者急性期和恢复期双份血清标本，若后者的抗体效价比前者有,4,倍或,4,倍以增长上才有诊断意义。,病毒感染的病原学检查,病毒感染的实验诊断方法,病原学诊断,显微镜检查,病毒分离培养与鉴定,抗原检测,核酸检测,血清学诊断,抗体检测,IgM,、,IgG,一、标本采集、运送和处理,（一）标本采集,采集时间：尽早采集（越早越好）,标本种类：根据感染的部位、可能感染的病毒类型选择标本种类,无菌采集标本：必要时用抗生素或抗真菌药处理,血清学检查标本：双份血清,（二）标本的运送与保存,1.低温送检,4,可保存数小时，,-,70,可长期保存,对冷冻标本应避免反复冻融,2.,保湿送检,50%,甘油盐水保存送检,病毒转运培养基（,virus transport medium,，,VTM,）含,0.5%,明胶或牛血清白蛋白的,Hanks,液,3.,无菌送检,二、病毒形态学检查,1.光学显微镜,仅用于大病毒颗粒和包涵体的检查。,简便、快速，但敏感性低，有些病毒感染细胞后不形成包涵体,狂犬病毒胞浆内包涵体（内基小提）,巨细胞病毒胞核内包涵体,2.电镜及免疫电镜,直接检查标本中的病毒颗粒，快速，可确诊。但敏感性低（,10,6,/ml,）,免疫电镜敏感性高，但只能用于已知病毒的检测）,乙型肝炎病毒电镜图,轮状病毒电镜图,3.病毒大小的测定方法,（1）电子显微镜直接测量,（2）超过滤法,（3）超速离心法,（一）病毒分离和鉴定的一般程序,动物接种,组织培养,标本采集,标本处理后接种,鸡胚接种,卵黄囊膜,尿囊液,羊膜腔液,绒毛尿囊膜,观察囊膜病变,血凝试验,血凝抑制试验,CPE,EM,包涵体,空斑试验,红细胞吸附,中和试验,观察发病,抗原检测,抗体检测,病理检查,三、病毒的分离与鉴定,（二）病毒的分离,鸡胚培养,动物接种,组织培养,1.动物接种,常用动物,小鼠、大白鼠、豚鼠、家兔、猴等。不同病对动物的敏感性不同，根据病毒种类加以选择。,接种途径,按病毒侵袭部位选择相应的接种途径：,乙型脑炎病毒及狂犬病毒 小鼠脑内接种,柯萨奇病毒 乳鼠腹腔接种,乙肝病毒 黑猩猩静脉注射,流感病毒 鼻腔滴种,用途,分离鉴定病毒，制备疫苗，制备抗血清,2.鸡胚培养,常用于粘病毒、疱疹病毒和痘类病毒的分离培养,接种途径及方法,新鲜受精卵 接种病毒,3839,713d,卵黄囊接种,羊膜腔接种,尿囊腔接种,绒毛尿囊膜接种,绒毛尿囊膜表现有痘病毒的特异性损伤,3.组织培养,将人或动物离体的活组织或分散的活细胞在体外人工控制的条件下使其生长繁殖的一种技术。,组织培养的类型,（1）组织块培养,（2）器官培养 人胚气管呼吸道病毒；,人胚肠 肠道病毒,（3）细胞培养最常用,原代和次代细胞培养,对病毒敏感，但制备费时费力，只能传,2,3,代。,二倍体细胞,培养,原代细胞反复传代（,40,50,代）仍保持二倍体染色体特性。病毒分离和,疫苗制备的首选细胞株,。,传代细胞,培养,来源于肿瘤细胞或突变的二倍体细胞，常用于病毒的分离鉴定，但不能用于制备疫苗。,（三）病毒的鉴定,病毒的初步鉴定,动物感染范围及潜伏期,对鸡胚的敏感性,在细胞培养中的表现,理化性质的测定,最后鉴定,血清学鉴定:中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验等,病毒在细胞培养中的表现,（1）细胞代谢作用改变,（培养液颜色变化）,正常细胞代谢：培养液由红变黄,病毒增殖，抑制细胞代谢：培养液颜色不变或更红,病毒在细胞内增殖后，使宿主的形态发生不同程度改变，这种由病毒增殖引起的细胞形态变化，称为细胞病变效应。,（2）细胞病变（cytopathic effect，CPE）,细胞变圆、融合、肿胀、细胞空泡、核浓缩、形成嗜酸性或嗜碱性包涵体等。,某些病毒感染细胞后不出现,CPE,（4）干扰现象,当两种不同的病毒同时或先后感染同一细胞时，其中一种病毒可抑制另一种病毒的增殖，称为病毒的干扰现象。,鼻病毒,无CPE,鼻V.Poli.V,无CPE,Poli.V,有CPE,（5）红细胞吸附及吸附抑制试验,受感染的宿主细胞膜含病毒抗原（血凝素），可吸附鸡、豚鼠或猴红细胞,如果在培养瓶中加入相应的血凝素抗血清，则不出现红细胞吸附现象，即红细胞吸附抑制试验阳性,（6）血凝及血凝抑制试验,含有血凝素的病毒能吸附一定种类的哺乳动物或禽类的红细胞，使红细胞凝集。该现象可被相应的血凝素抗体抑制，称为血凝抑制试验，可用于分型。,新分离病毒的鉴定,（1）病毒的大小及形态,（2）核酸类型:,5-溴-2-脱氧尿苷（BUDR）能抑 制DNA复制，而不抑制RNA病毒。,（3）乙醚敏感试验:,有包膜病毒对乙醚敏感，经乙醚作用后，失去感染性,（4）耐酸试验,肠道病毒耐酸，在pH3的环境下稳定，鼻病毒不耐酸，在pH3的环境下被灭活,病毒的血清学鉴定,中和试验、补体结合试验、血凝抑制试验等,四、病毒的血清学诊断,单份血清IgM测定 早期诊断,双份血清IgG测定 4倍以上增长，有诊断意义,五、病毒的分子生物学检测,多种分子生物学方法。检测以不同形式存在的病毒基因片断。敏感、特异、简便、快速，标本用量少。,核酸电泳技术,核酸杂交技术,PCR,基因芯片技术,真菌感染的病原学诊断,以直接镜检和分离培养为主,不染色标本检查,染色标本检查,标本直接检查,分离培养,生化反应,动物学试验,显微镜检查,抗原检测,一、标本采集,毛发 皮(甲)屑 痰 血 脑脊液 分泌物 穿刺液,二、,直接镜检,（一）不染色标本检查,直接采取标本制片、置显微镜下观察，若发现真菌菌丝或孢子存在时，即可初步判定为真菌感染。,标本封固液 低倍或高倍显微镜,封固液,KOH溶液：适于检查致密的难以透明的材料（如毛发、指甲、鳞屑等）,墨汁：,主要用于检查有荚膜的真菌（如新型隐球菌）,生理盐水：观察真菌的出芽现象，,脓汁、尿液、脑脊液等也可用。,水合氯醛石炭酸乳酸封固液：透明力较强，只限于不透明的标本。,新生隐球菌（墨汁负染）,（二）染色标本检查,革兰染色,各种真菌均为革兰阳性。常用于深部感染真菌的的染色检查。,乳酸酚棉蓝染色,适用于各种真菌的直接检查。真菌被染成蓝色。,糖原染色,菌体均染成红色。用于标本直接涂片及组织病理切片染色。,荧光染色,可用于直接涂片、培养涂片及组织切片。,白假丝酵母菌革兰染色,三、真菌的分离培养,是目前鉴定真菌的唯一方法。,常用培养基为沙保培养基,（,22,28,）,深部真菌可用血琼脂培养基或脑心葡萄糖血琼脂培养基置,37,培养,真菌常用培养方法,1.试管斜面培养：最常用。常用于分离培养、菌种保存。,2.大培养：常用于纯种的培养、研究。,3.小培养：可有效观察真菌的结构（菌丝、孢子）及生长发育，用于菌种鉴定。,四、真菌鉴定,形态特点：菌丝、孢子及某些特殊结构的特征,菌落特点：包括生长速度、菌落性质、菌落形态、大小及颜色,特殊试验：,芽管形成试验,生化试验：主要用于深部感染真菌的鉴定,动物试验,抗原检测,核酸检测,毒素检测,