流式细胞仪原理及应用(HIV).ppt
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1、碧迪医疗器械(上海)有限公司碧迪医疗器械(上海)有限公司上海市上海市静静安嘉里中心安嘉里中心3 3座座1010楼楼李苏辉李苏辉流式细胞仪原理及仪器维护保养白细胞的组成白细胞的组成 白细胞的组成及其分化抗原白细胞的组成及其分化抗原白细胞在分化成熟过程中,不同的发育阶段和不同亚类的白细胞出现或白细胞在分化成熟过程中,不同的发育阶段和不同亚类的白细胞出现或消失的表面标记,这是区分白细胞的重要标志。消失的表面标记,这是区分白细胞的重要标志。19861986年世界卫生组织年世界卫生组织命名委员会建议应用命名委员会建议应用CDCD系列来统一命名白细胞分化抗原系列来统一命名白细胞分化抗原白细胞(CD45)淋
2、巴细胞单核细胞(CD14/15)粒细胞(CD15)B cell(CD19等)NK cell(CD16/56)T cell(CD3)嗜酸性粒细胞嗜碱性粒细胞中性粒细胞巨噬细胞Th cell(CD4)Tc cell(CD8)2SHA-LFR032-20080930-4N 13E for Jerel细胞毒性T淋巴细胞;分泌穿孔素、IFN、TNF等。特点:MHC-1类分子限制、直接接触、反复杀伤自然杀伤细胞(NK):抗体依赖细胞介导的细胞毒作用、淋巴因子介导细胞毒作用、抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用补体系统的活化(经典、凝集素、替代途径)。作用(溶胞作用、吞噬条理作用、趋化性、炎症反应等)中和抗原:形
3、成免疫复合物,被吞噬细胞清除(条理作用)、毒素中和作用、感染中和作用体液免疫和细胞免疫的作用体液免疫和细胞免疫的作用淋巴因子依赖的细胞毒作用3免疫应答的过程及免疫应答的过程及ThTh细胞的作用细胞的作用 免疫应答:细胞免疫体液免疫Th细胞作用:Th1分泌IL-2、INF等,前者可诱导Th、Tc分裂增值;Th2分泌IL-4、IL-5,可使B细胞活化,产生抗体B细胞完全活化需要Th帮助 4流式细胞仪原理流式细胞术(Flow cytometry)对于处在流动状态的细胞或生物颗粒同时进行多参数的快速的分析和定量的技术5TTCHCDCD3 3CD3CD3CD8CD8CD4CD4流式细胞仪检测原理及在T细
4、胞分析中应用7AnalyzeAnalyzeIncubateIncubate8激发光源与荧光标记物9FACSCalibur流式细胞仪仪器结构液流系统光学系统激光光源激光光源光收集系统光收集系统电子系统光电转换光电转换数据处理系统数据处理系统软件系统10液流系统-鞘液11流式细胞仪原理 Injector Tip荧光信号及前向角、侧向角散射光聚焦的激光光束鞘液鞘液12光学系统激光(Laser,light amplification by stimulated emission of radiation)是一种相干光源,它能提供单一波长、高强度及稳定性高的光照激光波长:488nm,635nm13检测信
5、号 散射光信号FSC:前向角散射光SSC:侧向角散射光(90度散射光)荧光信号荧光染料光学滤片14检测信号15FALS SensorLaser前向角散射光信号 16前向角散射光信号17 散射光信号散射光信号散射光信号前向角散射光信号前向角散射光信号前向角散射光信号(FSC)(FSC)(FSC)FSC-FFSC-Forwardorward (A Angelngel L Light)ight)S Scattercatter在激光束正前方的检测器在激光束正前方的检测器,为前向散射光检测为前向散射光检测器器 FSCFSC的强度与细胞或其他颗粒的大小的强度与细胞或其他颗粒的大小,形状及形状及 optic
6、al homogeneity optical homogeneity 有关有关FSCFSC用于检测细胞或其他粒子的表面属性用于检测细胞或其他粒子的表面属性如如:大小大小 18FALS Sensor90LS SensorLaser侧向角散射光信号19侧向角散射光信号20 侧向角散射光信号侧向角散射光信号(SSC)(SSC)SSC-SSSC-Sideide (A Angelngel L Light)ight)S Scattercatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器,也也称为称为9090度散射光检测器度散射光检测器 SSCSSC的强度与细胞或其他颗粒的
7、大小的强度与细胞或其他颗粒的大小,形状及形状及 optical homogeneity optical homogeneity 有关有关SSCSSC用于检测细胞内部结构用于检测细胞内部结构如如:胞浆内颗粒多少胞浆内颗粒多少,核质比核质比 21流式细胞仪的检测信号:散射光FSCFSC,前向角散射光,前向角散射光,代表细胞大小代表细胞大小SSCSSC,侧向角散射光,侧向角散射光,代表细胞粒度代表细胞粒度Right Angle Light Detector Cell ComplexitySSCForward Light Detector Cell Surface Area FSCIncident L
8、ight Source22荧光信号荧光信号每种荧光染料均有特定的激发波长,并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长.利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号23光学系统FCM的光学系统是由若干组透镜,滤波片,小孔组成24光路光路 -滤片特性滤片特性 长通滤片 允许长于设定波长的光通过 短通滤片 允许短于设定波长的光通过 带通滤片 允许一定带宽的波长通过25460 500 540460 500 540460 500 540SP 500SP 500LP 500LP 500BP500/50BP500/50 长通 短通 带通光学滤片26荧光信号27荧光信号28 光路光路
9、-滤片特性滤片特性 当以当以 4545o o 角角放置长通滤片时放置长通滤片时,该滤片可以通过该滤片可以通过一定波长的光一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长同时也可以阻断并折射该波长以下的光以下的光 这种方式的滤片称为二向色性长通滤片这种方式的滤片称为二向色性长通滤片(dichroic filter)dichroic filter)2930光学系统31电子系统当细胞携带荧光素标记物,通过激光照射区时,受激激发,产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号,这些信号经A/D转换成数字信号,送计算机进行储存、作图、统计分析32发射波长Wavelength(nm)40045050055060065
10、070010008006004002000PEFITCPerCP75033流式细胞仪原理荧光信号650nm700nmFL3650 and Above500nm600nmFL1530/30FL2585/42Relative IntensityFITCPEPerCPWavelength(nm)550nm34检测器检测器Photomultiplier tube(PMT)Photomultiplier tube(PMT)将光学信号转变为电脉冲将光学信号转变为电脉冲(数字数据数字数据)信号信号 35单平台绝对计数管中预先加有准确定量的Beads流式细胞仪获取数据后,由各目标群的含量,可以计算出相对含量%
11、由各目标群与Beads的相对量计算,得到该细胞群的绝对含量计算公式:细胞获取数Beads总量细胞/L=Beads获取数 样本量注:Beads总量见TruCOUNT管外包装MultiSET系统中,样本量为50 L36单平台绝对计数使用TriTEST或MultiTEST试剂,在TruCOUNT管中完成全血的淋巴细胞绝对计数TruCOUNT管中预先加有准确定量的Beads,每批TruCOUNT管的Beads含量一致由各目标群与Beads的相对量计算,得到该细胞群的绝对含量使用直接荧光标记抗体组合,一步处理外周血使用免洗技术,溶血后直接上机检测标本操作简便,省时省力,计数结果重复性好37淋巴细胞分析使
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