色谱分析—概述.ppt

单击此处编辑母版标题样式,*,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,单击此处编辑母版标题样式,色谱分析,第一节 色谱法概述,一、色谱法的特点、分类和作用,混合物最有效的分离、分析方法。,俄国植物学家茨维特在,1906,年使用的装置：,色谱原型装置，如图。,色谱法是一种分离技术，,试样混合物的分离过程也就是试样中各组分在称之为色谱分离柱中的两相间不断进行着的分配过程。,其中的一相固定不动，称为,固定相,；,另一相是携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为,流动相,。,碳酸钙,（固定相）,色素混合液,石油醚,(,流动相）,1906,年，,Tsweet,发现色谱分离现象,色谱柱,色带,植物色素分离图示,色谱法的特点,（,1,）,分离效率高,复杂混合物，有机同系物、异构体。手性异构体。,（,2,）灵敏度高,可以检测出,g.g,-1,(10,-6,),级甚至,ng.g,-1,(10,-9,),级的物质量。,（,3,）,分析速度快,一般在几分钟或几十分钟内可以完成一个试样的分析。,（,4,）应用范围广,气相色谱：沸点低于,400,的各种有机或无机试样的分析。,液相色谱：高沸点、热不稳定、生物试样的分离分析。,不足之处：,被分离组分的定性较为困难。,色谱法的分类,1,按两相分子的聚集状态分类,流动相 固定相 类型,液相色谱,液体 固体 液,-,固色谱,液体 液体 液,-,液色谱,气体 固体 气,-,固色谱,气体 液体 气,-,液色谱,气相色谱,超临界流体色谱法,流动相为超临界流体,色谱法分类（续前）,2,按固定相的固定方式分类,3,按分离机制分类,平面色谱,纸色谱,薄层色谱,高分子薄膜色谱,柱色谱,填充柱色谱,毛细管柱色谱,分配色谱,吸附色谱,离子交换色谱,空间排阻色谱,毛细管电咏法,毛细管电色谱法,毛细管电泳,二、色谱过程、分离原理及特点,色谱过程,指被分离组分在两相中的“分配”平衡过程,以吸附色谱为例,见图示,吸附 解吸再吸附 再解吸 反复多次洗脱被测组分分配系数不同 差速迁移 分离,图示,分配系数的微小差异吸附能力的微小差异,微小差异积累较大差异吸附能力弱的组分先流出；吸附能力强的组分后流出,back,色谱分离原理,色谱分离基于各组分在两相之间平衡分配的差异,平衡分配可以用分配系数和分配比来衡量,色谱分离特点,1,不同组分通过色谱柱时的迁移速度不等,提供了分离的可能性,2,各组分沿柱子扩散分布峰宽,不利于不同组分分离,三、色谱流出曲线与术语,1.,基线,无试样通过检测器时，检测到的信号即为基线。,2.,保留值,（,1,）时间表示的保留值,保留时间（,t,R,）：,组分从进样到柱后出现浓度极大值时所需的时间；,死时间（,t,M,）：,不与固定相作用的气体（如空气）的保留时间；,调整保留时间（,t,R,）：,t,R,=,t,R,t,M,（,2,）用体积表示的保留值,保留体积（,V,R,）：,V,R,=,t,R,F,0,F,0,为柱出口处的载气流量，,单位：,m L /min,。,死体积（,V,M,）：,V,M,=,t,M,F,0,调整保留体积,(,V,R,),：,V,R,=,V,R,V,M,3,.区域宽度,用来衡量色谱峰宽度的参数，有,三种表示方法,：,（,1,）,标准偏差,(,)：,即,0.607,倍峰高处色谱峰宽度的一半。,（,2,）,半峰宽,(,Y,1/2,),：色谱峰高一半处的宽度,Y,1/2,=2.354,（,3,）,峰底宽,(,W,b,),：,W,b,=4,四、分配系数与色谱分离,分配系数和容量因子：相平衡参数,分配系数,K(,平衡常数,),：,指在一定温度和压力下，组分在色谱柱中达分配平衡后，在固定相与流动相中的浓度比（色谱过程的相平衡参数）,注：,K,为热力学常数,与组分性质、固定相性质、流动相性质及温度有关,实验条件固定，,K,仅与组分性质有关,五、,色谱定性与定量方法,1.色谱定性分析,(1)利用保留值及其规律定性,各物质在一定的色谱条件下均有确定不变的保留值，因此,保留值可作为定性指标,。,利用纯物质对照定性,利用文献值对照定性,纯物质对照定性,实现方法,利用保留时间定性,用相对保留值定性,用已知物增加峰高法定性,文献值对照定性分析（GC）,实现方法,测定保留指数,I,优点：无需纯物质；保留指数具有较好的重现性和精密度；只与固定相和柱温有关。,缺点：对结构复杂的物质，缺乏数据。,适用范围：适用于简单混合物，无需纯物质。,（2）与其他分析仪器联用的定性方法,Sample,Sample,5890,1.0,DEG/MIN,HEWLETT,PACKARD,HEWLETT,PACKARD,5972A,Mass,Selective,Detector,D,C,B,A,A,B,C,D,Gas Chromatograph(GC),Mass Spectrometer(MS),Separation,Identification,B,A,C,D,色质谱联用仪（,GC-MS,；,LC-MS,）,色谱,-,红外光谱仪联用仪；,组分的结构鉴定,:,外标法,外标法也称为标准曲线法,。,特点及要求：,外标法不使用校正因子，准确性较高,操作条件变化对结果准确性影响较大,对进样量的准确性控制要求较高，适用于大批量试样的快速分析,内标法,原理：,利用被测物与内标物校正因子的比值不变来进行定量的。,首先用被测物标准品和内标物配制标准溶液，求得校正因子比值：,然后，样品中加入内标物，再由它和样品的峰面积来计算：,f,is,f,i,/f,s,内标物与被测组份校正因子的比值；,m,i,被测组份i的含量；,m,s,加入内标物的量；,A,s,内标物的峰面积；,A,i,组份i的峰面积；,(a),内标法的准确性较高，操作条件和进样量的稍许变动对定量结果的影响不大。,(b),每个试样的分析，都要进行两次称量，不适合大批量试样的快速分析。,内标物要满足以下要求：,（,a,）,试样中不含有该物质；,（,b,）,与被测组分性质比较接近；,（,c,）,不与试样发生化学反应；,（,d,）,出峰位置应位于被测组分附近，且无组分峰响。,内标法特点,与外标法比较：,1.外标法：,2.内标法：,可以推导出：,思考题,色谱分离的原理及过程。,第二节 薄层层析（,Thin-layer chromatography,）,1,、基本原理,薄层层析法是色谱分析技术的一种,一般是将固体吸附剂涂布在平板上形成薄层作为固定相。当液相（展开溶剂）在固定相上流动时，由于吸附剂对不同组分的吸附力不一样，不同组分在展开溶剂中的溶解度不一样，点在薄板上的混合样品随着展开剂的移动速率也不同，因而可以彼此分开。（即通过吸附,-,解吸,-,再吸附,-,再解吸的反复进行，而将样品各组分分离开来）,Thin-Layer Chromatography:A Two-Component Mixture,More polar!,Less polar!,s,o,l,v,e,n,t,f,r,o,n,t,o,r,i,g,i,n,mixture,s,o,l,v,e,n,t,f,r,o,n,t,c,o,m,p,o,n,e,n,t,B,c,o,m,p,o,n,e,n,t,A,o,r,i,g,i,n,s,o,l,v,e,n,t,f,r,o,n,t,c,o,m,p,o,n,e,n,t,B,c,o,m,p,o,n,e,n,t,A,o,r,i,g,i,n,Increasing Development Time,Thin-Layer Chromatography:Determination of,R,f,Values,R,f,of component A =,d,A,d,S,R,f,of component B=,d,B,d,S,The R,f,value is a decimal fraction,generally only reported to two decimal places,Thin-Layer Chromatography:Qualitative Analysis,固定相：氧化铝,Acidic:-Al-OH,Neutral:-Al-OH +-Al-O,-,Basic:-Al-O,-,硅胶吸附薄层层析,吸附薄层中常用的吸附剂为,氧化铝和硅胶,硅胶：表达式为,SiO,2,XH,2,O,。层析用硅胶是一种多孔性物质，它的硅氧环交链结构表面上密布极性,硅醇基（,Si,OH,），,这种极性的硅醇基能和许多化合物形成,氢键,而产生吸附,.,硅胶吸附薄层层析的特点：,硅胶的吸附能力比氧化铝稍弱，其吸附活性也与含水量呈负性相关。,硅醇基显较弱的,酸性,，因而，硅胶只能用于中性、或酸性成分的分离，碱性成分不能用它分离。,硅胶的活化温度通常为,105,110,，不能过高。,2,、操作步骤,薄层板的制备,1,、调浆,称取,硅胶,3,克,，加,0.5%,的羧甲基纤维素钠,8,毫升,，调成均匀的糊状。,2,、涂布,取洁净的干燥玻璃板均匀涂层。,3,、干燥,将玻璃板水平放置，室温下自然凉干。,4,、活化,70,烘干,30,分钟。切断电源，待玻璃板面温度下降至不烫手时取出。,展开剂的选择,1,、位置,：用铅笔距底边,2cm,水平线上均匀确定,4,个点。每个样品间相距约,1cm,。,2,、取样,：用毛细管分别吸取氨基酸溶液，取样量为毛细管柱高,5cm,。,3,、点样：,点样毛细管轻轻接触薄层表面点样。加样后原点扩散直径不超过,2mm,。,Ala Arg Gly Mix,轻触疾起,操作步骤,点样,(a),点状点样,(b),条状点样,(c),颈部点样,(d),沟槽点样,半自动点样仪,手动点样器,操作步骤,展层、显色,Ala Arg Gly Mix,将薄层板,点样端,浸入展层,-,显色剂，展层,-,显色剂液面应,低于,点样线。盖好层析缸盖，上行展层。当展层剂前沿离薄板顶端,2cm,时，停止展层，取出薄板，,用铅笔描出溶剂前沿界线,，用热风吹干或在,85,下烘干，即可显出各层斑点。,物理显色,含有共轭双键的有机物质能吸收紫外光，将分离后的薄层板置于紫外灯下，组分薄层呈现暗色斑；如果采用硅腔,GF(,或其它含有荧光指示剂的吸附剂,),铺成的薄层，在紫外光照射下，整个薄层呈显黄绿色荧光，斑点部分呈现暗色，更为明显。,利用,蒸气熏显色,时，常用的试剂有固体碘、浓氨水、液体溴。进行显色时，把这些易挥发的试剂放置在密闭容器内（例如标本瓶、标本缸、干燥器等），使它们的蒸气充满整个容器，将已展开并已挥发去溶剂的薄层板放入其中，使之显色。,化学显色,的方式通常有直接喷雾法和浸渍法两种。,化学显色常用的显色剂剂大致可以分为两类，即通用显色剂和专属性显色剂。,通用显色剂：对未知化合物的检测，可以考虑先用通用显色剂。这种显色剂是利用它与被测组分的氧化还原反应、脱水反应及酸碱反应等而显色的，常用的有,50,的硫酸溶液、酸碱指示剂溶液、,5,磷钼酸乙醇溶液、荧光显色剂等。,：,结果计算,Rf=,斑点至原点距离,溶剂前缘至原点距离,小心量出斑点中心至原点中心距离，再量出原点中心至溶剂前沿的距离，计算出它们的,值。,根据,值，鉴定出混合样品中氨基酸的种类，并绘出层析图谱。,薄层色谱扫描仪,定义：,纸色谱分离法又称纸层析法，是根据不同物质在两相中的,分配系数,不同而进行分离的一种微量分离方法。,载体,层析纸（滤纸）；,固定相,滤纸上的吸湿水分；,流动相,有机溶剂（展开剂）。,纸色谱,思考题,简述,TLC,的操作步骤。,概念：,离子交换分离法是利用,离子交换剂与溶液中的离子之间所发生的交换反应,进行分离的方法。,（二）离子交换色谱,仪器设备简介,离子交换全套装置,离子交换树脂的结构,-,网络骨架,苯乙烯系、丙烯酸系、酚醛系、环氧系,离子交换树脂结构,骨架：,接有功能基团，本身是惰性,功能基团：,连接在骨架上，可与相反离子结合,待交换分子：,在吸附阶段可与活性离子交换，与骨架上的功能基团结合,活性离子：,与功能基团所带电荷相反的可移动的离子,活性离子为阳离子，称阳离子交换树脂，与阳离子发生交换,活性离子为阴离子，称阴离子交换树脂，与阴离子发生交换,基质 电荷基团 反离子,商品名,纤维素,OCH,2,COO,-,Na,+,CM-,纤维素,纤维素,-O-,（,CH,2,）,2,-,N,+,H,（,C,2,H,5,）,2,Cl,-,DEAE-,纤维素,聚苯乙烯,SO,3,-,Na,+,732,阳离子树脂,聚苯乙烯,N,+,（,CH,2,）,4,Cl,-,717,阴离子树脂,聚苯乙烯磺酸型阳离子交换树脂的制备,离子交换树脂的形状结构示意图,带,正,电荷多蛋白紧密结合,带,负,电荷多蛋白流过层析柱,阳离子交换树脂工作示意图,离子交换拄层析操作方式,一、离子交换剂的处理、转型和再生,二、分离物质的交换,三、物质的洗脱与收集,一、离子交换剂的处理和转型,一般程序：水泡，悬浮，酸或碱浸泡，洗涤至中性,疏水性离子交换剂,用,2-4,倍的,2mol/L NaOH,或,2mol/L HCl,溶液处理,亲水性离子交换剂,用,0.5mol/LNa0H,或,0.5mol/LHCl,溶液处理；,转型与再生：由一种反离子转到另一种反离子的过程,。,欲使阳离子交换剂转成钠型时，则需用,NaOH,处理；欲使其转成氢型时，则需用,HCl,处理；欲使其带铵离子时，则需用,NH,4,OH,或,NH,4,C1,处理。,目的：使离子交换剂带上所希望的离子或基团,二、物质的洗脱与收集,梯度混合器及形成的,梯度变化,离子强度,梯度洗脱,pH,值梯度洗脱,产生梯度溶液的三种装置及形成的梯度变化,C=C,B,-,（,C,B,-C,A,）（,1-V,2,/V,1,）,B1/A1,C,A,、,C,B,梯度混合器,A,瓶、,B,瓶的浓度；,A1,、,B1,A,瓶、,B,瓶的横切面积；,V,2,流经层析柱的体积，,V,1,梯度洗脱液的总体积。,线性和阶梯式梯度溶液分离牛血清白蛋白的图谱,在,pH3,左右,AA,与阳离子交换树脂的结合牢固程度：,碱性,AA,中性,AA,酸性,AA,。,洗脱顺序则是：,酸性,AA,中性,AA,碱性,AA,