实验二-微量凯氏定氮法测定总氮量.ppt

,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,实验二,总氮量的测定,凯氏定氮法,一,目的：学习凯氏定氮法,测定蛋白质含量,的原理和操作技术,二,原理：通过含氮有机物与浓硫酸共热生成硫酸铵，后与浓碱反应产生氨经硼酸吸收后用标准无机,酸滴定即可测出待测物中的总氮量,三,试剂：,浓硫酸（化学纯）、粉末硫酸钾硫酸铜混合物、,NaOH,、,硼酸、盐酸、田氏指示剂（甲烯蓝乙醇与甲基红乙醇混合）、面粉,四,器材：,凯氏定氮烧瓶、凯氏定氮蒸馏装置、,50,ml,容量瓶、,3,ml,微量滴定管、分析天平、烘箱、电炉、,100,ml,蒸馏烧瓶、小玻璃珠,五,操作步骤,六,实验报告,二、原理,生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，蛋白质的含氮量约为16，测出含氮量则可推知蛋白含量。,消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。,甘氨酸的消化过程可表示如下：,CH,2,NH,2,COOH+3H,2,SO,4,2,CO,2,+3SO,2,十,4,H,2,O,十,NH,3,2NH,3,+H,2,SO,4,(,NH,4,),2,SO,4,浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸汽将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的摩尔数,(,相当于待测物中氨的摩尔数,),计算出待测物中的总氮量。,本法适用于0.2 2.0,mg,的氮量测定。,三、试剂,1,、浓硫酸,200,mL,2,、,粉末硫酸钾硫酸铜混合物,16,g,K2S04,与,CuS04.5H20,以 3,：,1,配比研磨混合,3,、,30,氢氧化钠溶液,1 000,mL,4,、,2,硼酸溶液 5,000,mL,5,、标准盐酸溶液,(,约,0,01,mol,L),6,、,混合指示剂,(,田氏指示剂,),由,50,mL0,1,甲烯蓝乙醇溶液与,200,mL0,1,甲基红乙,l,醇溶液混合配成，贮于棕色瓶中备用。这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色范围很窄且灵敏。,7,、市售标准面粉和富强粉各,2,g,五、操作方法,1.样品处理,原因:,某一固体样品中的含氮量是用,100,g,该物质,(,干重,),中所含氮的,g,数来表示,(,),。,方法:一般样品烘干的温度都采用,105,，因为非游离的水都不能在,100,以下烘干。,在称量瓶中称一定量磨细的样品(如,0.1,g,左右的干燥面粉)，然后置于,105,的烘箱内干燥,4,小时。用坩埚钳将称量瓶放人干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥,1,小时后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重。,若样品为液体,(,如血清等,),，可取一定体积样品直接消化测定。,2,消化,取,4,个,100,mL,凯氏烧瓶 标号。各加,l,颗玻璃珠，在,1,及,2,号瓶中各加样品,0.1,g,，,催化剂,(,K,2,S0,4,CuS0,4,?5H,2,O)200 mg,，,消化液,5,mL,。,在,3,及,4,号瓶中各加,0,，,1,mL,蒸馏水和与,1,及,2,号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。每个瓶口放漏斗，在通风橱内的电炉上消化。注意加样品时应直接送人瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。,当消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出,SO,2,白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。,定容：冷却后，加蒸馏水约,10,mL,。,(,注意慢加，随加随摇,),。然后将瓶中溶物倾人,50,mL,的容量瓶中，并以蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并容量瓶，用水稀释到刻度，混匀备用。,改进型凯氏定氮仪结构,特点：将蒸汽发生器、蒸馏器和冷凝器组成一个整体，体积小，安装容易，操作简便。,(1),水蒸汽发生器和反应室,(2),冷凝器和通气室,(3),排水柱,关键:搞清水管系统,蒸馏器的洗涤,接通冷凝水，先向蒸汽发生器中加入一定量的水,(先关闭进水口,再关闭出水口,以排水口高度为宜,),用酒精灯将其加热烧开。,水的自动喷出：,将蒸馏水由加样室加入反应室，,将酒精灯移开片刻，,打开自由夹，使冷水进入蒸汽发生器，,如此反复清洗,3-5,次。,清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶盛有,5,mL,，,2,硼酸溶液和,1,2,滴指示剂的混合液。如不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干净。,3蒸馏,过程：,准备:,取,50,mL,锥形瓶数个，各加入,5,mL,2,硼,酸溶液和,1,2,滴指示剂，溶液呈淡紫色，用表面皿覆盖备用。,关闭冷凝水，打开自由夹，使蒸汽发生器与大气相通。将一个盛有硼酸和指示剂溶液的锥形瓶放在冷凝器下，并使冷凝器下端浸没在液体内。,加样:,用移液管取,5,mL,消化液，细心地加入反应室，随后加入,30,NaOH,溶液,5,mL,，关闭自由夹，在加样漏斗中加少量水做水封。,蒸馏:,关闭自由夹,打开冷凝水,(,注意不要过快过猛，以免水溢出,),。,点燃酒精灯,蒸馏开始,当观察到锥形瓶中的溶液由紫变绿时,(,约,2,3,分钟,),，开始计时，蒸馏,3,分钟，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约,1,cm,，,同时用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外侧，继续蒸馏,1,分钟，取下锥形瓶，用表面皿覆盖瓶口。,蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述。如此,3,5,次。最后将自由夹同时打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉，继续下一次蒸馏。,待样品和空白消化液均蒸馏完毕，同时进行滴定。,4.滴定,全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。,5.计算,总氮量,=,C,(V,1,-V,2,),0.014/w,消化液量,(,ml)/,滴定消耗用液量,(,ml),c,为标准盐酸溶液摩尔浓度；,V,1,为滴定样品用去的盐酸溶液平均,mL,数；,V,2,为滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均,mL,数,w,为样品重量,(,g),。,14,为氮的相对量子质量。,若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则，,样品中蛋白质含量,(,),二总氮量,6,25,思考题,1,、何谓消化？如何判断消化终点？,2,、在实验中加入粉末硫酸钾硫酸铜混合物的作用是什么？,3,、固体样品为什么要烘干？,4,、蒸馏时冷凝管下端为什么要浸没在液体中？,5,、如何证明蒸馏器洗涤干净？,6,、本实验应如何避免误差？,