第十一章荧光分析法.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,第十一章 荧光分析法,浙江大学药学院 吴永江,钱永健,荧光分析法（,fluorometry,）,是利用物质的荧光光谱特征（谱带位置，强度）进行分析的方法。,1575年：愈创木切片的黄色溶液可以发出天蓝色荧光,1852年：,Stokes,阐明荧光发射机制（分光计观测奎宁和叶绿素的荧光，发现波长稍长于入射光的波长,认识到荧光为,“,重新发光,”,而不是漫射光。,第一节,荧光分析法基本原理,一、分子发光,分子发光：处于基态的分子吸收能量（电、热、化学和光能等）被激发至激发态，然后从不稳定的激发态返回至基态并发射出光子，此种现象称为发光。发光分析包括荧光、磷光、化学发光、生物发光等。,物质吸收光能后所产生的光辐射称之为荧光和磷光。,（一）分子荧光的产生,1.分子能级、荧光及磷光的产生,分子能级,=,电子能级,(,Ee,)+,振动能级,(,Ev,)+,转动能级,(,Er,),2.,去活化过程,（,Deactivation,）,处于激发态分子不稳定，通过辐射或非辐射跃迁等去活化过程返回至基态。这些过程包括：,1,）,振动弛豫,（,Vibrational,Relaxation,VR,）,在液相或压力足够高的气相中，处于激发态的分子因碰撞将能量以热的形式传递给周围的分子，从而从高振动能层失活至低振动能层的过程，称为振动弛豫。,2,）,内转换,（,Internal Conversion,，,IC,）,对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如,S2-S1,；,T2-T1,。,3,）,外转换,（,External Conversion,，,EC,）,受激分子与溶剂或其它分子相互作用发生能量转换而使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程，也称,“,熄灭,”,或,“,猝灭,”,。,4,）,体系间跨跃,（,Intersystem Conversion,，,ISC,）,体系间跨跃是发生在两个不同多重态之间的,无辐射跃迁,，如从,S1,到,T1,，,该跃迁是禁阻的。然而，当不同多重态的两个电子能层有较大重叠时，处于这两个能层上的受激电子的自旋方向发生变化，即可通过自旋,-,轨道耦合而产生无辐射跃迁，该过程称为体系间跨跃。,5,）,荧光发射,分子电子从第一单重激发态（,Kasha,规则）的最低振动能级在很短时间（,10,-9,-10,-6,s,）,跃迁到基态各振动能级时所产生的光子辐射称为荧光。由于各种去活化过程的存在，荧光辐射能通常要比激发能量低，或者说，荧光波长大于激发波长（,Stokes,效应）。,6,）,磷光发射,从单重态到三重态分子间发生系间跨跃跃迁后，再经振动弛豫回到三重态最低振动能层，最后，在,10,-4,-10,s,内跃迁到基态的各振动能层所产生的辐射。,（二）激发光谱和发射光谱,改变激发波长，测量在最强荧（磷）光发射波长处的强度变化，以荧光强度对激发波长作图即得到,激发光谱,（,excitation spectrum）。,激发光谱形状与吸收光谱形状完全相似，经校正后二者完全相同！这是因为分子吸收光能的过程就是分子的激发过程。,激发光谱可用于鉴别荧光物质；在定量时，用于选择最适宜的激发波长。,发射光谱（,emission spectrum）,即,荧光光谱(,fluorescence spectrum),。,一定波长和强度的激发光照射荧光物质，产生不同波长和强度的荧光，以荧光强度对其波长作图即为荧光发射光谱。由于不同物质具有不同的特征发射峰，因而使用荧光发射光谱可用于鉴别荧光物质。,激发光谱的特征,1.,Stokes,位移,与激发（或吸收）波长相比，荧光发射波长更长。,2.荧光光谱形状与激发波长无关,不管激发波长如何，电子都是从第一电子激发态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层。,3.荧光光谱与吸收光谱呈镜像对称关系,原因解释1：能级结构相似性,荧光为第一电子激发单重态的最低振动能层跃迁到基态的各个振动能层而形成，即其形状与基态振动能级分布有关。,吸收光谱是由基态最低振动能层跃迁到第一电子激发单重态的各个振动能层而形成，即其形状与第一电子激发单重态的振动能级分布有关。,由于激发态和基态的振动能层分布具有相似性，因而呈镜像对称。,原因解释2：位能曲线（,Frank-Condon,原理）,由于电子吸收跃迁速率极快（,10,-15,s,），,此时核的相对位置可视为不变（核较重）。当两个能层间吸收跃迁的几率越大，其相反跃迁的几率也越大，即产生的光谱呈镜像对称。,二、荧光与分子结构,（一）荧光产生的条件,1.分子应能吸收紫外可见光，即具有荧光结构。（内因）,2.具有足够大的荧光量子产率（,fluorescence quantum yield），,即：分子吸收紫外可见光后，有足够数量的荧光光子产生。,荧光量子产率也称荧光效率（,fluorescence efficiency）,介于01之间，其大小由化学环境和结构共同决定。,（二）影响荧光,及荧光强度的因素,1.分子结构（内因）,1,）跃迁类型：通常，具有,-,*,及,n-,*,跃迁结构的分子才会产生荧光。而且具,-,*,跃迁的量子效率比,n-,*,跃迁的要大得多（前者,大、寿命短、体系间跨越小）。,2,）共轭效应：共轭度越大，荧光越强。,em,=278nm,f,=0.11,em,=321nm,f,=0.29,em,=404nm,f,=0.36,3,）刚性结构：分子刚性（,Rigidity,）,越强，分子振动少，与其它分子碰撞失活的机率下降，荧光量子效率提高。,如荧光素（,f,=0.92）,与酚酞（,f,=0,）；,芴（,f,=1,）,与联苯（,f,=0.18,）。,4,）,取代基：给电子取代基增强荧光（,p-,共轭），如,-,OH,、,OR,、,-NH,2,、,-CN,、,NR,2,等；,吸电子基降低荧光，如,-,COOH,、,-C=O,、,-NO,2,、,-NO,、,-X,等；,重原子降低荧光但增强磷光，如苯环被卤素取代，从氟苯到碘苯，荧光逐渐减弱到消失，该现象也称重原子效应。,2.外部因素,1）,溶剂效应：,溶剂极性可增加或降低荧光强度（改变,*,及,n,*,跃迁的能量）,。,2）温度：温度增加，荧光强度下降（因为内、外转换增加、粘度或,“,刚性,”,降低）。因此体系降低温度可增加荧光分析灵敏度。,3）,pH,值：具酸或碱性基团的有机物质，在不同,pH,值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变；对无机荧光物质，因,pH,值会影响其稳定性，因而也可使其荧光强度发生改变。,4）荧光熄灭剂：荧光分子之间或荧光分子与其他分子（溶剂或溶质）相互作用引起荧光强度降低的现象，称为荧光熄灭。,常见的荧光熄灭剂：卤素，重金属离子，氧分子，硝基化合物，重氮化合物，羰基化合物等。,当荧光物质浓度过高时，可吸收自身的荧光发射，称为荧光自吸或荧光自熄灭。,5）散射光：只要激发波长不是太大，瑞利散射一般不影响荧光；而拉曼散射光波长随着激发波长增大而增大，可与荧光光谱重叠。,（三）荧光试剂,1.荧光胺（,fluorescamine,）：,与脂肪族和芳香族伯胺反应生成具有强荧光衍生物。,2.邻苯二甲醛（,OPA）:2-,巯基乙醇,pH910，,与多数氨基酸反应。,3.丹酰氯（,Dansyl,-,Cl,）：1-,二甲氨基-5-氯化磺酰萘,能衍生的物质：伯胺、仲胺，含酚羟基的生物碱,4.无机离子螯合剂：无机离子与具有共轭体系的配位体生成螯合物，可产生荧光。,第二节 定量方法,一.荧光强度与浓度的关系,荧光强度与吸收的光强度成正比：,根据,Beer,定律，有：,当,Elc,0.05,时：,即：在,极稀,的溶液中，荧光强度与浓度成正比。,思考题,：为什么荧光分析的灵敏度比紫外可见分光光度法高？（10,2,10,4,倍,）,二.定量方法,1.校正曲线法,由于荧光强度与很多因素有关，难以测得绝对值，常以浓度最大的对照溶液的荧光强度为100（调不到100时可调至其他值），空白溶液的荧光强度为0，测定其他溶液的荧光强度。,如果对照溶液在紫外光下不稳定，可用其他对照溶液（常用硫酸奎宁）为基准。,2.外标一点法（比例法）:,荧光分析的特点,：,灵敏度高：视不同物质，检测下限在,0.10.001,g/,mL,之间。可见比,UV-,Vis,的灵敏度高得多！,WHY,？,选择性好：可同时用激发光谱和荧光发射光谱定性。,结构信息量多：包括物质激发光谱、发射光谱、光强、荧光量子效率、荧光寿命等。,应用不广泛：主要是因为能发荧光的物质不具普遍性、增强荧光的方法有限、外界环境对荧光量子效率影响大、干扰测量的因素较多。,第三节 荧光分光光度计,1,）光源：氙灯、高压汞灯、激光；,2,）样品池：石英（低荧光材料）；,3,）两个单色器：选择激发光单色器，,分离荧光单色器,；,4,）检测器：光电倍增管。,光源与检测器处于相互垂直的位置,本章,要求,1.基本概念：荧光，磷光，瑞利散射，拉曼散射，激发光谱，发射光谱，荧光量子产率,2.荧光产生的原理,3.荧光产生的条件,4.影响荧光强度的因素,5.荧光分析法为什么比,UV/,Vis,法灵敏度高？,6.荧光分析的定量方法,